[发明专利]新型磷脂酶D

说明书

技术领域

本发明涉及具有合成磷脂酰肌醇的能力的新型的磷脂酶D。

背景技术

磷脂可用于乳化剂、化妆品的成分、药物处方以及脂质体的制备。来自天然物的磷脂通常含有磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)、鞘磷脂等混合物。为了从天然磷脂中分离特定的磷脂，可以进行甲醇、乙醇、异丙醇、己烷、氯仿等溶剂的萃取或重结晶等的溶剂区分法，使用硅胶、氧化锂、离子交换树脂等吸附剂的柱层析分离法，利用CdCl₂复合物或乙酰化物等的衍生物的分离法。

由天然物(大豆卵磷脂等)中进行PI的分离和纯化，这例如如日本特开平5-97873号公报和日本特开平5-97872号公报所述。日本特开平5-97873号公报中记载了将含有PI的脂类溶解于非极性溶剂中，将其与含有碱性物质的含水极性溶剂接触，然后对非极性溶剂层和不含有碱性物质的新的含水极性溶剂进行液液分配，将PI萃取到含水极性溶剂层中的方法。日本特开平5-97872号公报中记载了将含有PI的混合磷脂溶解于含有水或乙酸溶液的低级醇和非极性溶剂的混合溶剂中，进行高效液相色谱的方法。由于上述方法需要大量的溶剂等，所得PI的高纯度化较难，高纯度品极为昂贵。

另外，也有有机化学合成PI的方法，但是合成途径含有包含保护和脱保护的很多步骤地复杂的合成途径，因此效率不高。

以往也进行了通过酶法制备磷脂的尝试。磷脂酶D[EC 3.1.4.4](以下也称为“PLD”)是将甘油磷脂的磷酸二酯键水解，催化生成PA和醇部分的酶。除了该水解活性之外，PLD也催化磷脂的极性基团的相互变换。该工艺被称为“磷脂酰基转移反应”。利用磷脂酰基转移反应，可以由天然富含的磷脂类合成天然量少的磷脂类。

象磷脂酰甘油(PG)、PE或PS等的几种天然磷脂是采用PLD催化磷脂酰基转移反应，由卵磷脂或PC合成(例如日本特开平6-269287号公报、日本特开平5-292981号公报、日本特开2002-51794号公报、以及日本特开2005-261362号公报)。日本特开平6-269287号公报中记载了使用以链霉菌属的微生物为起源的PLD、在特定的反应条件下进行碱交换反应、获得目标磷脂的方法，成功地生成了PG、PE、PS和磷脂酰丙醇。日本特开平5-292981号公报中，在通过来自微生物的PLD进行碱变换反应、获得目标磷脂时使用螯合剂，成功地生成了PG、PE和PS。也生成了PI，但是碱转换率低。日本特开2002-51794号公报中记载，不使用有机溶剂，将作为原料的磷脂、具有羟基的受体、PLD和水充分混合，进行均化，在15-65℃下进行酶促反应，成功地生成了PS和PG。日本特开2005-261362号公报中记载了利用磷脂酰基转移反应的磷脂酰丝氨酸的生成方法。

日本特开平3-87191号公报中记载了使用PLD制备PI的方法。该方法中，将PLD与作为原料的混合磷脂作用时，利用PLD不与磷脂中的PI作用、而是选择性地水解其它磷脂成分，由此获得未反应的PI。该方法必须是在添加PLD之后进一步添加碱或酸性磷酸酶。

目前，对于PLD的性质和结构进行了研究(例如R.Ulbrich-Hofmann等人，Biotechnology Letters，2005年，27卷，535-544页)。另外，为了提高PLD的有效性，还进行了各种改变(例如日本特开2004-97011号公报和日本特开2005-80519号公报、以及西川等人，日本农艺化学会2004年大会讲演要旨，268页)。日本特开2004-97011号公报和日本特开2005-80519号公报中记载了对有机溶剂或热的稳定性提高的修饰型PLD。并且西川等人，日本农艺化学会2004年大会讲演要旨，268页中记载，获得了对具有萘基的磷脂——磷脂酰-1-萘酚(P1NAP)具有分解活性的变异PLD。

发明内容

本发明的目的在于提供可以由磷脂高效地制备磷脂酰肌醇(PI)的方法。本发明的目的还在于提供具有合成PI的能力的修饰型PLD。并且，本发明的目的在于提供筛选PLD的方法，该PLD具有合成有二醇基的酰基甘油磷脂的能力。

本发明提供具有合成磷脂酰肌醇的能力的修饰型磷脂酶D(以下也称为“合成PI的修饰型PLD”)。该合成PI的修饰型PLD是具有合成磷脂酰肌醇的能力的修饰型磷脂酶D，其含有