[发明专利]一种裂解肽的C端肽键的方法和确定肽的C端氨基酸序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及裂解肽的C端的肽键的方法和确定肽的C端氨基酸序列的方法。

相关技术

关于获自天然来源的肽或蛋白(在下文笼统地称为肽)的氨基酸序列的信息对于研究生物学特征和功能是不可缺少的。目前，基于相应的基因信息，即编码这些肽的基因组基因或由mRNA制备的cDNA的碱基序列，将肽和蛋白的氨基酸序列确定为推导的氨基酸序列。或者，通过直接分析肽的序列的方式确定蛋白质的这些氨基酸序列。在这些情形中，仍旧需要肽的部分氨基酸序列的信息来鉴定编码肽的基因组基因或由mRNA制备的cDNA。

通常，认为对于对肽的部分氨基酸序列的了解，肽的N端氨基酸序列和C端氨基酸序列是有用的。例如，在从由大量mRNA制备的cDNA文库中选择要获得的编码肽的cDNA的过程中，如果其N端氨基酸序列和C端氨基酸序列已经确定，那么基于在两端的氨基酸序列制备核酸探针，和使用所述探针选择要获得的cDNA是可能的。此外，通过使用基于两端的氨基酸序列制备的寡核苷酸引物进行的PCR方法选择性地扩增要获得的cDNA是可能的。

作为分析肽的N端氨基酸序列的方法，使用了确定通过Edman降解法顺序降解N端氨基酸而获得的氨基酸衍生物的方法。

在另一个方面，作为分析肽的C端氨基酸序列的方法，提议了鉴定C端氨基酸的方法，其中通过化学反应将C端氨基酸顺序降解，并且基于在起始肽和截短的肽之间的分子量的差异确定被降解的C端氨基酸(非专利相关文献1-3)。

非专利相关文献1公开了通过化学反应顺序降解C端氨基酸的方法。所述方法是增加肽的C端氨基酸的选择性水解的方法，其中将干燥的肽加热到90℃，并且使其与产自高浓度的五氟丙酸(CF₃CF₂COOH)水溶液或高浓度的七氟丁酸(CF₃CF₂CF₂COOH)水溶液的蒸汽反应。

非专利相关文献2和3公开了使用五氟丙酸酐((CF₃CF₂CO)₂O)的乙腈溶液或七氟丁酸酐((CF₃CF₂CF₂CO)₂O)的乙腈溶液取代高浓度的全氟链烷酸水溶液来选择性降解C端氨基酸的方法。所述文献指出将干燥的肽与产生自上述溶液的蒸汽在-18℃下反应，并且使所述系统避开进入由所述溶液蒸发产生的水分子，由此防止了副反应的发生。

已经报道了这些降解C端氨基酸的常规方法，其通过在下述反应式(I)中指出的脱水反应和在下述反应式(II)指出的反应进行。即，根据反应式(I)，曾经形成具有噁唑酮环的结构，作为来自C端氨基酸的反应中间体。接下来，通过使全氟链烷酸与所述噁唑酮环作用来获得C端氨基酸的选择性降解反应。

【Ka1】

【ka2】

根据在所述非专利相关文献中公开的方法，除了选择性降解目标C端氨基酸序列之外，还发生了在N端的肽的丝氨酸残基(-NH-CH(CH₂OH)-CO-)的裂解，在N端的苏氨酸残基的裂解和在C端的天冬氨酸残基的裂解。因此，存在仅选择性降解C端氨基酸序列的问题。此外，由于N，O-酰基转移反应，其是非意欲的裂解的引发物，在丝氨酸残基α位置的氨基酸和β位置的羟基之间，在苏氨酸残基α位置的氨基酸和β羟基(β-OH基团)之间，C端氨基酸序列的顺序降解反应可能在所述转移反应位点被抑制。

考虑到这些情况，专利文献1公开了在温和条件下，使用链烷酸酐如乙酸酐和甲酰胺顺序降解肽的方法。然而，在该反应下，存在低灵敏性的问题。

【专利文献1】WO 2005/078447

【非专利相关文献1】Tsugita，A.等，Eur.J.Biochem(欧洲生物化学杂志).，第206卷，第691～696页，1992

【非专利相关文献2】Tsugita，A.等，Chem.Lett.(化学通讯)，第235-238页，1992

【非专利相关文献3】Takamoto，K.等，Eur.J.Biochem.(欧洲生物化学杂志)，第228卷，第362-372页，1995

发明公开内容

本发明待解决的问题