[发明专利]用于生成萜的方法和用于该方法的MEP转化后的微生物

说明书

技术领域

本发明涉及具有产生焦磷酸异戊烯酯和/或焦磷酸二甲基烯丙酯的外源途径的微生物，并且涉及在细胞和/或培养基中积聚类萜的方法。 

背景技术

类异戊二烯(也称为类萜或萜)是一大类、多样的具有可观经济效益的复杂天然产物。如今，大多从植物中提取或化学合成类异戊二烯作为药物(例如红豆杉醇、红没药醇、番茄烯、青蒿素)、动物饲料添加剂和食品着色剂(各种类葫萝卜素)或调味料和香料(例如薄荷醇、广藿香醇、香柏酮)。类异戊二烯是由异戊二烯单元(2-甲基-1，3-丁二烯)构成，并且所有天然的类异戊二烯的生物前体都是焦磷酸异戊烯酯(IPP)。类异戊二烯在活体细胞(在此仅涉及几种例如在激素调节(固醇)、光合作用(类胡萝卜素和其它))中起重要的作用。 

在活体细胞中，通过两条不同的途径，即依赖甲羟戊酸(下文称MEV)途径或不依赖甲羟戊酸途径或MEP途径都能够产生IPP。大多数生物体依赖专有的产生类异戊二烯化合物的途径，但是植物和一些微生物同时具有两条途径。通过MEV途径合成IPP的前体为在中心碳代谢中合成的乙酰辅酶A。通过MEP途径合成IPP的前体为在中心碳代谢中合成的糖酵中间体甘油醛-3-磷酸酯(GAP)和丙酮酸酯(PYR)。依赖甲羟戊酸途径和MEP途径都产生了 焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)和IPP，并且在IPP之后生成焦磷酸香叶酯(GPP)、焦磷酸法呢酯(FPP)和焦磷酸香叶基香叶酯(GGPP)的反应步骤不管使用依赖甲羟戊酸途径、MEP途径或两者在细胞中都是相同的。就是从这些中间体生成了各种天然的类异戊二烯化合物。 

通过传统的化学方法产生有机分子的化学工业愈加倾向于应用微生物细胞工厂的生产方法。朝向绿色化学驱使这种发展的主要推动力为：这种所谓的“生物技术方法”更加有利于环境，由微生物产生的许多化合物太复杂很难通过有机合成来获得以及微生物细胞工厂代表着特定化合物的无限供给。目前，类异戊二烯是通过从植物中提取或化学合成来大规模地生产。两种方法的主要缺点为产率较低以及成本高。第三种选择为通过体外酶转化来生产期望的类异戊二烯，但是该方法受限于可用的前体并且因此大多数情况下在经济上不可行。 

用于产生类异戊二烯的微生物的代谢工程可以由廉价的碳源用发酵方法导致大量的类异戊二烯的产生，并且由此解决了许多工业类异戊二烯生产中目前存在的问题(Maury等，2005，Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.100：19)，同时使得发现于天然化合物的类异戊二烯族中的巨大多样性的生物技术开发成为可能。 

由基因工程微生物已经产生了大量的类异戊二烯产物，包括柠檬烯(Carter等，2003，Phytochem.64：425)、类胡萝卜素(Kajiwara等，1997，Biochem.J.324：421)、表雪松醇(Jackson等，2003，Org.lett 5：1629)、紫杉二烯(Huang等，2001，Biorg.Med.Chem 9：2237)和其它。为了增强大肠杆菌(E.coli)中类异戊二烯的生成，已经将dxs基因(编码DXP合酶)、dxr基因(DXP还原异构酶)和idi基因(IPP异构酶)过量表达并获得了上述几种类异戊二烯产物的很好的结果(回顾于Maury 等，2005)。已经由大肠杆菌通过表达大肠杆菌青蒿酸生成链中来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的依赖甲羟戊酸途径获得了青蒿酸(amorphadiene)生成的额外增加(Martin等，2003，Nat.Biotechnol.21：796)。同样在酵母中已经产生了一些类异戊二烯化合物，其包括酿酒酵母中的表雪松醇(Jackson等，2003，Org.Lett.5：1629)、酿酒酵母中的番茄烯和β-胡萝卜素(Yamano等，1994，Biosci.Biotechnol.Biochem.58：1112)和产朊假丝酵母(Candida utilis)(Miura等，1998，Appl.Environ.Microbiol.64：1226)。在一些情况中，通过过量表达HMG 1(编码HMG-CoA还原酶)在酵母中已显示出类异戊二烯生成的增强(回顾于Maury等，2005)。 

尽管有上述的背景，仍然需要生成萜和类萜的另外的方法，特别是相对于现有已知的方法以较高产率和较低成本和时间密集的方式在微生物中积聚萜的方法。由此本发明的目的是提供一种生成满足这种需要的萜和类萜的方法。 

本发明的另一目的是解决生物体中足够量的萜前体的供给从而增强生物体中萜的积聚的问题。