[发明专利]用于骨髓干细胞（BMSC）成骨分化的方法及其用途

权利要求书

1.用于在体外或离体地从人骨髓干细胞获得骨原细胞、成骨细胞或 成骨细胞表型细胞或者获得包括所述细胞的细胞群的方法，其包括将所述 骨髓干细胞与人血清或血浆以及碱性成纤维细胞生长因子(FGF-b， FGF-2)或其生物活性变体或衍生物接触。

2.根据权利要求1的方法，其中所述人血浆或血清是该骨髓干细胞 自体的。

3.根据权利要求1或2中任一项的方法，其中所述骨髓干细胞不接 触任何得自非人动物的材料，例如血清组分。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述骨髓干细胞从人 受试者的生物样品中获得，所述生物样品优选为该受试者的骨髓样品。

5.根据权利要求4的方法，其中所述人受试者具有患骨相关疾病的 风险或者患有骨相关疾病。

6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其包括以下步骤:

(a)从包含BMSC的人受试者生物样品中回收细胞，所述生物样品 优选为骨髓样品；

(b)任选地，从(a)中回收的细胞中分离单个核的细胞，例如使用 适当的密度梯度离心或其他方法进行分离；

(c)将(a)的细胞或者优选(b)的细胞加入包含人血浆或血清以及 FGF-2或其生物活性变体或衍生物的培养基中，并培养该细胞-培养基混 合物，以使细胞贴壁于基质表面，例如像培养容器的玻璃或塑料表面；

(d)除去未贴壁的物质并将贴壁细胞在(c)中定义的培养基中进一步 培养，从而获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞样细胞，或者获得包含上 述细胞的细胞群。

7.根据权利要求6的方法，其包括(e)在培养12天到16天时收集 (d)中获得的细胞或细胞群，优选在约第14天时收集。

8.根据权利要求6的方法，其包括(e)在培养12天到16天时将(d) 的细胞或细胞群进行传代，优选在约第14天时传代；继续培养所述传代细 胞或细胞群；并在培养18天到24天时收集该细胞或细胞群，优选在约第 21天收集。

9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中FGF-2或其生物活性 变体或衍生物以低于10ng/ml、优选低于5ng/ml、甚至更优选为1、2、3、 4或5ng/ml的浓度存在。

10.可通过权利要求1至9中任一项的方法获得的人骨原细胞、成骨 细胞或成骨细胞表型细胞或者包含上述细胞的分离的细胞群。

11.权利要求10中所限定的分离的细胞群，其包含至少80％、优选 至少90％、更优选至少95％的人骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞。

12.权利要求10或11中任一项所限定的分离的细胞群，其包含少于 20％、优选少于10％、更优选少于5％的内皮样细胞。

13.人骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞，其特征在于它们共 表达(1)选自碱性磷酸酶(ALP)更具体地为骨-肝-肾型ALP、1型前胶 原氨基端前肽(P1NP)和骨涎蛋白(BSP)的至少一种成骨细胞标志物以 及(2)选自CD63和CD166的至少一种干细胞/未成熟骨原细胞标志物。

14.根据权利要求13的骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞， 其中适用以下任一项、多项或所有项:-所述细胞是骨钙蛋白(OCN)阴 性的；-所述细胞是CD34阳性的；-所述细胞对于CD90、CD73和CD105 中任何一种、两种或所有三种是阳性的；-所述细胞对于CD45、CD19和 CD14中任何一种、两种或所有三种是阴性的；-所述细胞是CD133阴性的。

15.根据权利要求13或14中任一项的骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型细胞，其中适用以下任一项或两项:-当接触成骨培养基时，所述细 胞可以矿化外部围绕物，或者合成含钙的细胞外基质；-所述细胞基本上不 向脂肪细胞谱系细胞或软骨细胞谱系细胞中的任一种分化，并优选地不向 脂肪细胞谱系细胞和软骨细胞谱系细胞两者分化。