[发明专利]用于骨髓干细胞（BMSC）成骨分化的方法及其用途

说明书

技术领域

一方面，本发明涉及用于骨髓干细胞(BMSC)的成骨分化(优选还 至少部分内皮分化)的体外或离体方法，并涉及这样的分化细胞的应用。 另一方面，本发明涉及特定的细胞类型和细胞群，它们表现出与先前公开 的骨原细胞和成骨细胞类似但却是新的特征。在相关的方面中，本发明提 供了上述方法、可使用该方法获得的细胞和细胞群以及本文具体描述的细 胞类型和细胞群的用途，特别是在治疗(优选骨治疗)领域的用途。

背景技术

同种骨髓移植(allogeneic bone marrow transplantation)的可行性在 患有重度成骨不全的儿童中得到了证实(Horwitz等1999.Nat Med 5(3): 309-13)。在该研究中，移植来源于骨髓的功能性间充质细胞，并促进形成 新的骨密质，这表明移植细胞分化为生成骨的成骨细胞。还报道了在患有 肱头骨坏死的患者中进行的自体骨髓移植(Hernigou等1997.J Bone Joint Surg Am 79:1726-1730)。因此，移植能够进行成骨分化的干细胞或者定向 (commit)为成骨分化的细胞可成为用于治疗骨相关疾病(特别是当所述 治疗需要生成新骨时)的很有前景的途径。

因此，非常需要提供适于作为骨相关疾病的疗法而移植的足量细胞(特 别是自体细胞)的有效技术。

尽管可以移植未分化的骨髓干细胞，然而这些细胞尚未定向至骨谱系， 因此所移植的干细胞中相当大的部分可能最终对骨组织的形成没有贡献。 另外，已经证实(Banff等2000.Exp Hematol 28:707-15)，当使用生长因 子(如FGF-2)进行处理时，骨髓干细胞的体外培养降低其增殖潜力及其 分化能力。例如，在该研究中，与新分离的骨髓相比，体外培养的骨髓干 细胞的骨形成率在第一次传代时已降低了36倍。因此，骨髓干细胞的体外 扩增可能降低其在移植后作为生成骨的成骨细胞来源的效率。

Martin等(Endocrinology 138:4456-4462，1997)证明，在2型成纤维 细胞生长因子(FGF-2)与胎牛血清(FCS)组分共同存在下体外培养骨 髓干细胞，使该细胞保持在未成熟状态(较少的碱性磷酸酶以及成纤维细 胞样的形态)，尽管该细胞在特定的成骨培养条件下能够在体外进行成骨 分化。然而，这样的未成熟细胞在体内向生成骨的成骨细胞的分化仍取决 于在移植时提供的适当信号。因此，虽然这样的细胞可能能够在体外进行 成骨分化，但是在体内其相当大的一部分可能仍然不变为成骨细胞。同样， Chaudhary等(Bone 34:402-11，2004)显示，经FGF-2处理的人骨髓干 细胞不表现任何成骨表型(不表达碱性磷酸酶)，并且事实上具有营养不 良的形态。类似地，Kalajzic等(J Cell Biochem 88:1168-76，2003)证明， FGF-2抑制成骨分化。

另外，制备用于人类治疗的材料应避免在培养基中使用非人动物的组 分，如血清组分(例如，FCS)。然而，如Kuznetsov等(Transplantation 70:1780-1787，2000)所示，同源或自体人血清的使用大大减弱了人骨髓干 细胞在体外形成集落和扩增以及在体内形成骨的能力。因此，Kuznetsov 等提出，使用FCS是骨髓干细胞的有效扩增及其形成骨的能力的前提。

Takagi等2003(Cytotechnology 43:89-96)在特定条件下在含有FGF-2 的供体血清中孵育人骨髓抽取物。由Takagi等2003如此获得的细胞群仅 表现出分化形成软骨的潜力，从而作者将其用于软骨再生中。

Kobayashi等2005(J Bone Joint Surg Br 87:1426-3)描述了用于在自 体供体血清中分离和维持人BMSC的特定条件，推断这些条件可提供充分 的人BMSC离体扩增，而同时保留其多分化潜能。Kobayashi等2005在 继代培养中使用FGF-2以促进BMSC进一步扩增而不分化。这些作者并 未公开会导致他们的细胞向骨原细胞或成骨细胞表型细胞发展的条件。

Lin等2005(Transplant Proc 37:4504-5)报道了在自体供体血清中延 长多能人BMSC的扩增。在某些条件下向细胞添加FGF-2和EGF不影响 细胞的增殖，并且不使细胞向成骨方向发展。