[发明专利]抗体依赖性细胞毒性检测

说明书

交叉参考相关申请

该申请要求2006年1月4日提交美国临时申请系列号60/756,301的利益和优先权。

技术领域

本申请涉及用于检测抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法和(在一些实施方案中)涉及不需要标记细胞的以实时方式对ADCC进行检测的方法。

背景技术

ADCC是免疫应答组成部分，其中IgG抗体结合到病原或致瘤靶细胞表面的抗原上，标识它们并通过NK效应细胞进行破坏。具有Fcγ受体(FcγR)的效应细胞识别结合到靶细胞的抗体的Fc区域并与之结合。因此抗体给予了由效应细胞介导的靶细胞杀伤特异性，在两种细胞类型之间形成一个桥梁并随后释放裂解颗粒。

一些治疗性抗体通过增强ADCC来发挥其生物活性。例如，一种用于治疗乳腺癌的人源化抗体能通过结合癌细胞表面上的HER-2抗原来增强ADCC。同样，一种用于治疗非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)的嵌合抗体通过结合淋巴瘤细胞表面上的CD20抗原来增强ADCC。

测定抗体是否诱导ADCC的技术通常涉及用放射性物质(例如Cr⁵¹)或荧光染料(例如Calcein AM)标记靶细胞。被标记的细胞与抗体和效应细胞(例如NK细胞或PBMC)孵育，并通过放射性或荧光的释放检测通过ADCC进行的靶细胞杀伤。在这种检测中靶细胞的标记需要使贴壁细胞脱离来进行标记。标记后，用悬浮状态的靶细胞进行检测，这对于贴壁细胞不是一种正常状态。此外，通常只在将靶细胞与效应细胞和抗体混合数小时后的一个时间点里测定ADCC介导的细胞杀伤的程度。已经开发出一种无标记检测，其中通过测定从裂解细胞的细胞质释放到无细胞上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)来检测细胞杀伤。但是，LDH法不是一种实时的检测，并且它不能将靶细胞的死亡和效应细胞的死亡区分开，因为两种类型的细胞在溶胞中都将释放LDH。

考虑到目前正在销售的或正在开发中的治疗性抗体产品的数量，存在着对能测定抗体ADCC活性的体外检测方法的需求。尤其是，需要一种高通量的、无标记的ADCC检测来实时监测ADCC，并且不需要让贴壁细胞脱离。

发明内容

本申请提供了体外检测ADCC的方法。方法是无标记的或需要较低水平标记的，因此和需要标记细胞的检测相比更容易操作并且更安全。在一些实施方案中，该方法还在贴壁细胞中进行，而不是在悬浮细胞中进行。此外，该方法可以以实时方式进行，能够追踪ADCC反应的动力学，因此能够比较不同抗体的ADCC动力学。并且和标准ADCC检测相比此处提供的方法灵敏度更高，能够检测不同抗体ADCC动力学的较小的差别。此外，在一些实施方案中，此处所提供的方法的简单性意味着比标准ADCC检测更快速，并且具有为高通量筛选ADCC活性进行优化的潜力。

此处提供的方法包括(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极之间的阻抗；和(b)向检测培养基中加入效应细胞和结合靶细胞的一种抗体。加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的阻抗下降表明在检测培养基中ADCC功能已经生效。加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的阻抗增高或未改变，能够表明在检测培养基中未发挥ADCC功能。

一方面，本申请描述了一种检测抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法，包括：(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极之间的阻抗；和(b)向检测培养基中加入效应细胞和结合靶细胞的一种抗体；其中加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的阻抗下降，表明在检测培养基中ADCC功能已经生效，而在加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的阻抗增高或未改变，能够表明在检测培养基中未发挥ADCC功能。该方法包括在规则周期中检测阻抗。包括从每次阻抗测量中导出细胞指数(CI)并确定细胞指数是否发生变化，其中使用下面的公式从每次阻抗测量中导出细胞指数，

其中R_b(f)和R_细胞(f)分别是在细胞存在或不存在情况下的频率依赖性电极电阻，N是阻抗检测处的频点(frequency points)数。可以使用系统进行该方法。可以每15分钟检测一次阻抗。

该方法可以进一步铺板靶细胞。在靶细胞铺板18到24小时之后加入抗体和效应细胞。靶细胞在基质上可以是单层。能以每孔2K到100K的密度铺板靶细胞(例如，每孔15K到25K之间，或大约每孔20K)。效应细胞对靶细胞的比例(E:T)可以是25:1。E:T可以超过10:1、超过50:1、或超过100:1。