[发明专利]测定病毒粒子/病毒抗原浓度的方法

说明书

本发明提供了一种测定样品中病毒粒子/病毒抗原浓度的方法。具体地说， 本发明涉及测定样品中流感病毒粒子/流感病毒抗原的浓度。本发明还涉及离子 交换基质在测定样品中病毒粒子和/或病毒抗原浓度中的应用。

发明背景

在制备抗病毒相关疾病的疫苗时通常需要大量病毒。因此要在合适的宿主 系统中以高产率生产各种病毒。现有技术中已经描述了一些增殖和培养病毒的 方法。使病毒增殖的常规方法包括，例如，在原代细胞或者甚至在更加复杂的 细胞培养物系统中培养病毒。例如，流感疫苗可来源于采用具胚鸡蛋的病毒增 殖培养物。在这些培养物中，从受感染鸡蛋的尿囊液中分离病毒，而用作疫苗 的抗原为完整或不完整病毒颗粒的形式。一些病毒，如流感病毒、狂犬病病毒、 腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒和蜱媒脑炎病毒也可采用特定的哺乳动物细 胞系来复制。

这些细胞培养物能够经济地复制病毒并提供相比，例如，鸡蛋更加可靠的 增殖系统。在哺乳动物细胞中培养病毒的方法描述于，例如，WO97/37000。

为实现高病毒产率，宿主系统、培养条件或要增殖的病毒必需相互适应。 尽管已经做出努力来优化各种增殖系统，但病毒增殖培养物的病毒主产率在不 同批次或生产轮次之间极为不同。因此，重要的是提供一种能确定某次病毒制 备的病毒产率的方法。

目前，流感病毒增殖培养物的主产率(primary yield)是通过，例如，测量血 凝素(HA)效价来测定的。此时，母鸡红血球的凝集被用来表示无细胞病毒制品， 如给定培养物的粗样品等分试样中病毒衍生的血凝素的量。通过提高该样品的 稀释度便可估算HA的量。血凝素的量表明了样品中病毒粒子的数目。然而， 该方法受毒株限制，且只是半定量的。事实上，只能测定灵敏度的2-步骤因子 (factor 2-step)。

或者，可采用广泛接受的单径向免疫扩散(文献中也称为SRID或SRD检 测)估算流感病毒产率。

该检测详细描述于《欧洲药典》(European Pharmacopoeia)第五版中。该检 测基于病毒抗原与其同源抗体在支持琼脂糖凝胶中发生的可视反应。优选将病 毒抗原掺入凝胶并使抗血清从加入点径向扩散经过固定的抗原。可观察到抗原 -抗体复合物形成的可测区。当外部和内部反应物之间建立平衡时，从外部反 应物位置开始的环状沉淀的面积与加入的抗原量成正比并与凝胶中的抗体浓 度成反比。用于该检测的标准抗原和标准抗体由英国的大不列颠国立生物标准 品和对照研究所(NIBSC，British National Institute for Biological Standards and Control)提供。注意，进行SRID检测时至少需要两天。

上述方法目前在该领域应用时的一个重要缺点在于，根据上述方法评价给 定的病毒增殖培养物的病毒主产率只能在已经从培养基分离病毒之后才能可 靠地进行。然而，从大量增殖培养物纯化病毒不仅费用昂贵而且耗时。目前还 不可能在数小时甚至更短时间内评价给定的病毒增殖培养物中的病毒量。

因此，需要有能够迅速提供有关病毒制品，如流感病毒增殖培养物，主产 率信息的方法。优选地，该测定方法应迅速提供结果，以使该结果可被用作判 断能否进一步处理病毒增殖培养物并对其进行纯化的基础。本发明解决了这一 问题，同时提供了额外的益处。

发明详述

本发明提供了一种在较短时间内测定含病毒样品中病毒粒子和或抗原浓 度的方法。所述含病毒样品可以是病毒增殖培养物，如MDCK细胞培养物的 粗制样品，且本发明所述方法采用所述培养物的等分试样进行。有利地是，检 测等分试样时无需对所有培养物进行下游纯化。因此，本发明提供了一种测定 样品中病毒粒子/病毒抗原浓度的方法，该方法包括以下步骤：

a)在允许病毒粒子和/或病毒抗原与离子交换基质结合的条件下将含有所 述病毒粒子和/或病毒抗原的样品施加于所述离子交换基质，从而将所述病毒粒 子和/或病毒抗原与其他样品组分分离；

b)从所述基质上洗脱所述结合的病毒粒子和/或病毒抗原；和

c)检测所述病毒粒子和/或病毒抗原；

其中，检测信号指示了样品中所述病毒粒子和/或病毒抗原的浓度。

在本发明过程中，已经发现给定样品中病毒粒子和/或病毒抗原的量与可被 离子交换基质优选阳离子交换基质结合并从其洗脱的病毒的量正相关。这点非 常奇怪，因为在本发明之前从未认为这种柱可用于定量分析病毒粒子，如流感 病毒粒子。