[发明专利]含有血凝素和基质蛋白的流感疫苗

说明书

将本文引用的所有文献以全文纳入本文作参考。

技术领域

本发明属于保护免受流感病毒感染的疫苗领域，具体涉及包含基质蛋白的疫苗。

背景技术

目前可以获得各种形式的流感病毒疫苗(例如参见参考文献1的第17和18章)。疫苗通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可能基于完整病毒颗粒，‘裂解’病毒颗粒，或者基于纯化的表面抗原。

血凝素(HA)是灭活流感疫苗的主要免疫原，参照HA水平(一般通过单径向免疫扩散(SRID)实验测定)标准化疫苗剂量。在现有疫苗中，一般每剂量含有约15μg HA/毒株。除了含有流感HA外，疫苗还可含有其它流感病毒蛋白。例如，所有现有疫苗都含有神经氨酸酶(NA)。参考文献2报道，欧洲流感疫苗也可含有大量其它流感病毒蛋白。例如，裂解疫苗、而非纯化的表面抗原疫苗中也可发现基质(M)蛋白。

除流感病毒抗原外，参考文献2报道，疫苗也可含有鸡蛋衍生的蛋白，如卵清蛋白。出现这些蛋白的原因是在疫苗生产过程中培养流感病毒的标准方法采用含胚的鸡蛋，由鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒。

发明内容

与疫苗生产中使用鸡蛋培养病毒相比，提出了在细胞培养物中培养病毒。在研究这种技术的过程中，本发明者出乎意料地检测到基质序列。具体说，虽然参考文献2在鸡蛋培养的病毒颗粒制备的纯化表面抗原疫苗中没有发现基质蛋白，但本发明者在细胞培养物中培养的病毒颗粒制备的纯化表面抗原疫苗中检测到基质蛋白。

因此，本发明提供一种由细胞培养物培养的病毒制备的含有流感病毒血凝素和基质蛋白的免疫原性组合物。

本发明也提供了一种含有流感病毒血凝素和基质蛋白而不含卵清蛋白的免疫原性组合物。该组合物也可不含其它鸡蛋蛋白(如卵类粘蛋白)和鸡DNA。

本发明也提供了一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在细胞培养物中培养流感病毒；(ii)由步骤(i)培养的病毒制备抗原组合物，其中所述抗原组合物含有血凝素和基质蛋白；和(iii)将所述抗原组合物与药物载体混合，得到所述免疫原性组合物。

观察到的具体基质蛋白是M1的片段。全长M1蛋白是27.8kDa的蛋白，但观察到的片段在低分子量SDS-PAGE凝胶上的分子量约为5kDa(见下)。它包含高度保守的氨基酸序列LSYSXGALA(SEQ ID NO：1)，其中X是A或T。因此，本发明提供一种含有流感病毒血凝素和基质蛋白的免疫原性组合物，其中所述基质蛋白的分子量小于20kDa，并包含与SEQ ID NO：1至少50％(如至少60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多)相同的氨基酸序列。观察到的另一种M1片段长度约75aa，缺少全长M1序列的N末端甲硫氨酸(例如，它含有氨基酸序列SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29)。因此，本发明提供一种含有流感病毒血凝素和基质蛋白的免疫原性组合物，其中所述基质蛋白是缺少天然M1序列的N末端甲硫氨酸的M1蛋白。所述基质蛋白可含有与SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29至少50％(例如至少60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多)相同的氨基酸序列。除缺少N末端甲硫氨酸外，该片段还可缺少N末端甲硫氨酸下游的一个或多个其它氨基酸。

虽然优选由细胞培养物中培养的病毒制备这些组合物，但是也可通过其它方式来制备，例如将基质蛋白加入鸡蛋衍生的疫苗中，使用纯化方法处理鸡蛋产生的病毒颗粒导致产生和存在基质蛋白，将基质蛋白与重组表达的HA(和任选的其它重组表达蛋白)混合等方式。

抗原组分的制备

本发明不使用完整病毒颗粒(WV)抗原，即不包括使用活病毒或完整灭活病毒颗粒的疫苗。然而，本发明抗原是非WV抗原，如裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原。本发明组合物包含至少两种流感病毒抗原：血凝素和基质。它们还可包含其它流感病毒抗原，如神经氨酸酶。一般由流感病毒颗粒(优选在细胞培养物中培养的病毒颗粒)制备抗原，但在一些实施方式中，可以在重组宿主(如使用杆状病毒载体的昆虫细胞系)中表达抗原，并以纯化形式使用该抗原[3，4]。然而通常，抗原来自病毒颗粒。

在由病毒颗粒制备非WV抗原的过程中，可以使病毒颗粒灭活。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种物质处理：去污剂、甲醛、β-丙内酯、亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二乙胺、乙酰乙烯亚胺、或其组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如UV射线或γ射线辐射。