[发明专利]生产β-赖氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产β-赖氨酸的方法。更具体地，本发明涉及重组微生物的使用，所述微生物包括去调控形式的、生产β-赖氨酸所必需的DNA分子。

背景技术

虽然与对应的α-氨基酸相比而言，β-氨基酸较少，但其仍以游离形式和存于多肽中的形式存在于自然界中。Cardillo和Tomasini，Chem.Soc.Rev.25:77(1996)；Sewald，Amino Acids 11:397(1996)。由于β-氨基酸比对应的α-氨基酸是更强的碱和更弱的酸，因此，含有β-氨基酸而非α-氨基酸的多肽具有不同的骨架原子模式，导致新的性质。

在20世纪50年代，L-β-赖氨酸在由链霉菌属(Streptomyces)所产生的几种强碱性肽抗生素中被鉴定到。通过水解产生L-β-赖氨酸的抗生素包括紫霉素，黄链菌素A，紫放线菌素，玫瑰丝菌素和地霉素。Stadtman，Adv.Enzymol.Relat.Areas Molec.Biol.38:413(1973)。β-赖氨酸也是由真菌诺卡氏菌属(Nocardia)所产抗生素，如菌霉素，的组分，并且β-赖氨酸可用于制备其他的生物学活性化合物。然而，β-赖氨酸的化学合成是耗费时间的，需要昂贵的原料，并且产生外消旋混合物。

发明概述

一方面，本发明提供通过构建重组微生物和培养所述微生物生产β-赖氨酸的方法，其中所述微生物具有去调控的赖氨酸-2，3-氨基变位酶和至少一个去调控的基因，该基因选自于赖氨酸生物合成途径中必需的基因。

另一方面，本发明提供β-氨基-ε-己内酰胺的生产方法，其包括上述用于β-赖氨酸生产的步骤。

另一方面，本发明提供ε-己内酰胺的生产方法，其包括上述用于β-赖氨酸生产的步骤。

发明详述

在下述的发明详述中，许多术语被广泛地使用。在此提供定义以利于本发明的理解。

术语β-赖氨酸指L-β-赖氨酸。

启动子：一段DNA序列，其指导结构基因转录产生mRNA。通常，启动子位于基因的5’区，靠近结构基因的起始密码子。如果启动子为诱导型启动子，则转录速率将响应于诱导物而增加。相反，如果启动子为组成型启动子，则转录速率不受诱导物的调控。

增强子：一种启动子元件。增强子可以提高特定基因转录成mRNA的效率，而不论该增强子相对于转录起始位点的距离或方向。

表达。表达是指由结构基因产生多肽的过程。该过程涉及基因转录为mRNA和该mRNA翻译为多肽。

克隆载体。一种DNA分子，如质粒，粘粒、噬菌粒或噬菌体，其具有在宿主细胞中自主复制的能力，且其可以用于基因操作中转化细胞。克隆载体通常含有一个或少数限制性内切酶识别位点，在这些位点处外源DNA序列可以以可确定的方式插入，而不导致载体的必需生物学功能的丧失；此外，还包括标记基因，该标记基因适用于鉴定和选择已经转化了该克隆载体的细胞。标记基因通常包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。

表达载体。一种DNA分子，其包含编码外源蛋白的克隆的结构基因，其提供外源蛋白在重组宿主中的表达。通常，克隆基因的表达被置于(即，有效地连接到)某些调控序列，如启动子和增强子序列的控制之下。启动子序列可以是组成型或是诱导型。

重组宿主。重组宿主可以是含有克隆载体或表达载体的任何原核或真核细胞。该术语也旨在包括已通过基因工程在宿主细胞的染色体或基因组中包含了克隆基因的那些原核或真核细胞。适合的宿主的例子见Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)[＂Sambrook＂].

本文中，基本上纯的蛋白质是指，如通过聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)后的单一条带所表明的，该期望的纯化蛋白质基本上不含污染的细胞成分。术语“基本上纯”还意在通过本领域技术人员所用的一种或多种纯度或同质性特征描述同质的分子。例如，基本上纯的赖氨酸2，3-氨基变位酶将显示出处于参数的标准实验偏差范围内的恒定和重复性特征，所述参数例如：分子量，色谱迁移，氨基酸组成，氨基酸序列，封闭或未封闭的N-端，HPLC洗脱曲线，生物活性，及其他此类参数。然而，该术语不意在排除赖氨酸2，3-氨基变位酶与其他化合物的人工的或合成的混合物。另外，该术语不意在排除从重组宿主中分离的赖氨酸2，3-氨基变位酶融合蛋白。