[发明专利]提取RNA的方法

说明书

本申请是2006年2月8日提交的共同未决美国临时申请No.60/771，510的部分继续申请。

技术领域

本发明涉及用于捕获和提取核糖核酸(特别是来自生物来源材料的核糖核酸)的简化方法的材料。

背景技术

应用到临床研究、临床诊断测试和药物开发中的现代分子生物学方法越来越多地利用了核糖核酸(RNA)的研究。RNA以信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)的形式存在。一些现代分子生物学技术例如Northern印迹、核糖核酸酶保护测定和RT-PCR需要在分析之前分离纯的未降解的RNA。对特定mRNA序列的存在性以及mRNA表达水平的研究已经大量应用。分析mRNA(尤其是使用微阵列)是分子生物学研究中的有力工具。通过测定样品中mRNA序列的水平可以确定单个基因的上调或下调。mRNA水平可以作为外部刺激或疾病状态的函数而被评估。例如，p53 mRNA水平的变化与多种细胞类型的癌症正相关。

另外，许多对人类健康有重大影响的病毒(包括HIV、HCV、西尼罗河病毒、马脑炎病毒和埃博拉病毒)具有RNA基因组。从体液或组织中快速且清洁地提取病毒RNA的能力对于病毒学研究和传染病诊断及治疗是重要的。

当前提取RNA的方法从多种方法之一开始，以破坏或裂解细胞、释放RNA进入溶液以及防止RNA被内源RNA酶降解。裂解将RNA与DNA和蛋白质一道释放出来，然后必须再从中分离RNA。之后，处理所述RNA以将其溶解或沉淀。Chirgwin等，Biochem，18，5294-5299(1979)公开了使用离液胍盐以同时裂解细胞、溶解RNA和抑制RNA酶。另一些方法通过在低pH下用苯酚/氯仿提取将溶解的RNA与蛋白质和DNA相分离(D.M.Wallace，Meth.Enzym.，15，33-41(1987))。常用的一步法RNA分离包括依次用4M胍盐、醋酸钠(pH4)、苯酚和氯仿/异戊醇处理细胞。将样品离心，通过加入乙醇将RNA从上层中沉淀出来(P.Chomczynski，Anal.Biochem.，162，156-159(1987))。美国专利4,843,155描述了一种方法，其中将酸性pH下的苯酚和胍盐稳定混合物加入到细胞。在使用氯仿进行相分离之后，通过用乙醇沉淀回收水相中的RNA。

另一些方法包括将热苯酚加入到细胞混悬液中，然后进行乙醇沉淀(T.Maniatis等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory(1982))；使用阴离子或非离子表面活性剂以裂解细胞并释放细胞质RNA；以及使用RNA酶抑制剂例如氧钒核糖核苷复合物(vanadyl riboside complex)和焦碳酸二乙酯(L.G.Davis等，“Guanidine Isothiocyanate Preparation of Total RNA”和“RNApreparation：Mini Method”in Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier，New York，pp.130-138(1991))。

美国专利5,234,809(Boom等)中公开了通过结合于玻璃或其它固相之上从生物来源中同时分离DNA和RNA的技术。通过暴露于含EDTA和表面活性剂Triton X-100的Tris HCl(pH8.0)中的强(>5M)硫氰酸胍溶液来裂解生物来源(例如血清或尿)中的细胞。通过与硅藻土或二氧化硅颗粒(其与DNA和RNA形成可逆的复合物)一起孵育从生物材料中纯化DNA和RNA。