[发明专利]评估解冻细胞的存活能力的方法

说明书

本发明涉及评估解冻细胞存活能力(viability)的方法。

为了IVF过程中的成功率，刺激卵巢以产生多于一个的卵母细胞 (oocyte)。结果，大多数IVF周期导致胚胎(embryo)的总数超过了用于在单个 周期中转移至个体患者的最适量(optimum)。对此问题合乎伦理和经济的方法 是胚胎冷藏(cryopreservation)。胚胎冷藏允许储藏特大数量的(supernumeracy) 优质胚胎直至它们能在后面的周期中被转移，从而减少了达到怀孕所需的刺 激卵巢药物处理周期的数目，并因此减少了患卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome)的风险(Trounson，1986)，且提供了对多胎妊娠的防 止。冷藏还允许在自发排卵周期或者雌激素和孕酮激素水平不超过天然存在 的水平的周期中替换(replacement)解冻的胚胎，因此增加了每个患者的怀孕 率。大多数的辅助受孕单位常规地提供前核的或早期卵裂期(early cleavage stage)的胚胎的冷藏。

利用了速度受控冷冻技术：在冷冻保护剂流体中缓慢冷却胚胎，从体温 降至-196℃(此处所有的细胞过程停止)，在该温度将它们储藏于液氮容器 中。所述的冷冻保护剂用于保护细胞免受损害。当将这些细胞解冻时，从液 氮中取出它们，解冻，除去冷冻保护剂，和培养细胞。导致细胞损害以及危 害解冻后功能和发育的几个因素与冷却和冷藏有关。细胞损害可由细胞内冰 (intracellular ice)的形成然后该细胞内冰的快速冷却引起；细胞外冰的形成也 导致在未结冰部分电解质浓度的增加以及细胞脱水。利用膜溶质相互作用 (membrane solute interaction)的体外模型检测到：脱水和复水(re-hydration)导 致脂质膜上的机械应力并引起物理变形和相(phase)行为的改变。这些物理改 变可在多种程度影响细胞：可改变细胞膜和细胞器；已显示围绕胚胎的透明 带(zona pellucida)在冷藏过程中遭受(一定量的)硬化，以及纺锤体进而染色体 分离会受到损害。近来，已显示一些基因受到冷冻和解冻过程的诱导，这说 明该细胞积极响应刺激(insult)。与冷冻保护剂组合的缓慢冷冻允许通过减少 细胞内冰和减少溶质浓度增加的影响来保护细胞免于上述有害的机制 (mechanism)。所述细胞外冰驱动细胞经由平衡过程脱水。更快速的方法，即 玻璃化(vitrification)，使用高浓度(high level)的冷冻保护剂和非常快速的冷 却，以使细胞内冰的形成最小化。它是非平衡方法。

冷冻和冰形成导致双层(即两层)脂质膜的脱水。借助冷冻(with freezing) 液体结晶至凝胶的相变导致磷脂的烃尾部的有序化成为更加紧密的和平行 的阵列，这可引起对水和阳离子的渗透性增加、整合膜蛋白的分离、膜结合 酶的活性降低、蛋白质的径向扩散的降低。精子和卵母细胞很可能经历类似 的作用，尽管它们的脂质构成非常不同。成熟卵母细胞具有位于减数分裂的 纺锤体处的微管。将温度降至25℃于10分钟使微管破裂，而且完全分裂 (dissolution)发生于0℃。在小鼠中重新升温导致微管的重建，但是这不发生 于人中，因为缺乏成核细管聚合(nucleate tubule polymerization)所需的中心粒 旁物质。因纺锤体解体，所得的卵母细胞往往可以具有非整倍性(aneuploidy) (即染色体数目异常)。冷冻还可通过降低透明带的胰凝乳蛋白酶敏感性和皮 质颗粒(cortical granule)而影响受精。实际上壳可能太“坚硬”。Linford和 Meyers使用单细胞凝胶电泳显示精子可能受到损伤。线粒体也易受冷藏损 伤。在冷藏和随后的培养过程中，卵母细胞DNA的退化似乎涉及细胞凋亡 (apoptosis)过程，并检测到典型标记(classic markers)和胱天蛋白酶(caspase)。 因此细胞经历程序性细胞死亡。感兴趣的是，还激活了与应激反应有关的基 因，包括与热休克蛋白、氧化应激清除剂(scavenger)和涉及葡萄糖代谢的酶 有关的基因。