[发明专利]荧光测定法

说明书

技术领域

本发明涉及对样品中非荧光物质进行测定的方法，进一步地涉及用于根据这种方法进行测定的装置。

背景技术

欧洲专利号EP 0,772,779描述了通过荧光猝灭的糖化蛋白质的测定法。如该文献所示例的现有技术描述了利用荧光猝灭的糖化血红蛋白的测定法，所述荧光猝灭是当所述糖化血红蛋白结合通过特定荧光团与硼酸基团的化学连接产生的缀合物时产生的。然后，这种依赖于浓度的猝灭与通过现有技术确定的传统光度测定法所测定的总血红蛋白的测定进行比较。

然而，在该现有技术方法期间，存在不可避免的非特异性水平的荧光猝灭，其不是由所述缀合物与糖化血红蛋白结合引起的，而是由固有的滤波效应引起的。这种固有的滤波效应是由血红蛋白分子本身所引起的，该血红蛋白分子本身吸收由血红蛋白吸收光谱与荧光激发和发射光谱的光谱重叠所引起的激发辐射和发射的荧光。在计算中必须补偿这种背景荧光猝灭，以允许特定猝灭的定量，该特定猝灭只是归因于糖化血红蛋白的浓度和由此它的量子。EP 0,772,779的发明人通过在适合的波长(例如，405nm或415nm)测定反应溶液的光密度，和根据该光密度测定减去总荧光猝灭的按比例要素，完成了这个。

在EP 0,772,779中公开的方法中，利用传统的光测方法诸如，在405nm或415nm吸光度测定总血红蛋白浓度。对于如这里所述的起作用的方法，使用者必须在独立的仪器上进行两个独立的测定：光度计测定总的光密度和荧光计测定荧光猝灭。对于具有任何商业应用的检验，例如在糖尿病治疗中，为该检验特定设计和制造的任何仪器必须因此具有荧光计和光度计的双功能性。这是昂贵的，更复杂的和不期望的。

如EP 0,772,779中所描述的通过血红蛋白的荧光猝灭具有两个组成。首先，在荧光激发和发射波长，与血红蛋白样品结合的初始瞬间荧光下降就象中性密度滤光片一样起作用；其次，与糖化血红蛋白和荧光缀合物试剂的化学结合的时间过程相关的依赖于时间的荧光信号猝灭。

发明内容

如上所述和下面进一步讨论的，本发明的目的是克服现有技术方法的问题，希望开发出显著改进的测定方法，以及设计一种自动获得期望结果的仪器。作为该仔细研究的结果，本发明人已经确定通过下面的荧光改变时间过程作为测定反应进程，可以从依赖于时间的荧光猝灭单独测定不依赖于反应化学的背景荧光改变，即，瞬时减少或增加，该依赖于时间的荧光猝灭归因于靶化合物与荧光试剂的化学结合。从这个出发，他们也已经发现当向荧光试剂添加物质时，测定荧光的改变，尤其是猝灭效应的改变可以用于计算本身不是荧光的物质的浓度。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种对样品中非荧光物质进行测定的方法，该方法包括：

(a)在溶液中进行测定样品和荧光标记化合物之间的反应，在时间t₀，样品和标记化合物结合；

(b)激发标记化合物中的荧光，其中标记物的性质和激发的性质是这样的：即，在通过标记化合物和非荧光物质的反应改变所述荧光的波长发生所述的荧光；

(c)随着反应进程检测所引起的荧光；

(d)从所检测的荧光计算F₀和F_∞值，F₀是在时间t₀时的荧光，F_∞是在时间t_∞时的荧光，这是所有的非荧光物质已经与标记化合物反应，或者反应已经达到平衡时的点；

(e)从F₀和F_∞值计算由于步骤(a)中反应的荧光中背景改变；和

(f)从所计算的值和适合的校准算法，确定与荧光标记化合物反应之前，在t₀时，样品中存在的非荧光物质的浓度。

如这里所用的，当提到待要测定的物质(分析物)时，术语非荧光不意指物质完全是非荧光的。而是它意指在相关的激发和发射波长，它具有对荧光标记化合物的不同激发和或发射光谱。

本发明的目前主要期望的应用是血液中糖化血红蛋白的测定。实际上，本发明的起源在于改善该测定的方法，特别是测定样品中糖化血红蛋白(即，葡萄糖已经非酶促地结合的血红蛋白)的数量或比例。因为这个原因，尽管本发明同样可以应用于许多不同物质，特别是这样的物质，其中样品含量的吸收特征易于干扰适合荧光团的荧光特征的物质的测定，下面的说明书将更经常地在这方面描述本发明。