[发明专利]中和针对因子Ⅷ的C1结构域的抑制性抗体的抑制活性的抗独特型抗体

说明书

现有技术和引言

本发明涉及针对因子VIII抑制性抗体的单克隆抗独特型抗体，所述 因子VIII抑制性抗体结合因子VIII的C1结构域，以及涉及产生这种单克 隆抗独特型抗体的细胞系，涉及这种单克隆抗独特型抗体作为药物的 用途，以及更特别地，涉及其用于制造治疗血友病A的药物的用途。

血友病A是与染色体X的异常相关的遗传疾病，其在受影响的人中 显示了自身不能凝结。这种疾病是涉及凝结的蛋白质因子VIII(FVIII) 蛋白的基因上突变的结果，其决定了血液中因子VIII的完全缺乏，或者 其部分不足。

血友病A是影响血液凝固的最常见的功能不全：在法国，5000人中 1名男性是患病的，其代表了患有血友病的患者的80％。另一种类型的 血友病，血友病B，影响患血友病的20％的患者：它起因于其他凝结因 子，称为因子IX中的缺乏。

血友病(A或B型)的当前的治疗包括静脉内施用缺乏的或缺失的凝 结因子。在法国，用于治疗血友病患者的因子VIII可以以分级和生物技 术法国实验室(Laboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies)(LFB)或国际药物实验室提供的血液衍生的药物的形 式，或以通过遗传工程方法制备的重组药物的形式来获得。编码因子 VIII的DNA已经被有效地分离并在哺乳动物细胞中表达(Wood et al.， Nature(1984)312：330-337)，它的氨基酸序列从cDNA推导出。

分泌的因子VIII(FVIII)是分子量300KDa(2332个氨基酸)的糖 蛋白，在内部凝结途径的活化中起到关键作用。无活性的FVIII由六个 区域组成：A1(残基1-372)、A2(残基373-740)、B(残基741-1648)、 A3(残基1690-2019)、C1(残基2020-2172)和C2(残基2173-2332)， 从N-末端到C-末端。在被分泌之后，FVIII作用于von Willebrand因子 (vWF)，其保护FVIII对抗血浆蛋白酶。FVIII在被凝血酶裂解时从vWF 上解离。这种裂解引起了B结构域的消除和异二聚体的形成。FVIII以这 种形式在血浆中循环。这种异二聚体由重链(A1、A2)和轻链(A3、 C1、C2)组成。

当FVIII注入到血友病患者中时，它与患者的血液循环中的von Willebrand因子结合。活化的因子VIII作为活化的因子IX的辅助因子起 作用，加速因子X向活化的因子X的转变。活化的因子X将凝血酶原转 变成凝血酶。然后凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，发生凝结。

因子VIII施用遭遇的主要问题是在患者中针对因子VIII的抗体的出 现，称为“抑制性抗体”。这些抗体中和了因子VIII的促凝血活性，其 在注入时就失活了。因而，施用的凝结因子在可以停止出血之前被破 坏了，其导致严重的并发症，因而引起治疗失效。进一步的，某些遗 传学的非血友病患者可能发展出针对内源因子VIII的抑制物：这称为获 得性血友病。

研究显示了抗因子VIII免疫反应是多克隆IgG型的，主要属于IgG4 和IgG1亚类，更罕见地属于IgG2。IgG3亚类从不出现。轻链通常是 Kappa型的。IgG4的过量呈递对于具有长期的建立的抑制物的血友病患 者是更显著的。FVIII分子的C2和A2结构域是免疫反应的有帮助的目 标，尽管在某些情况下，检测到针对A3结构域的抗体。当血友病患者 的血浆穿过具有固定的FVIII的免疫吸附柱时，有可能纯化总抗FVIII抗 体。回收的数量通常高于100μg/10mg总IgG(Gilles JG et al.(1993) Blood；82：2452-2461)。已经开发了动物模型来研究因子VIII的抑制物的 形成；用人类重组因子VIII免疫的大鼠显示了多克隆型的快速免疫反应 (Jarvis et al.，Thromb Haemost.1996 Feb；75(2)：318-25)。抗因子VIII 抗体干扰因子VIII的功能的机制有很多，包括干扰因子VIII的蛋白水解 裂解、干扰因子VIII与不同配体例如von Willebrand因子(vWF)、磷脂 (PL)、因子IX、活化的因子X(FXa)或APC(活化的蛋白C)的相互 作用。