[发明专利]低聚核酸的加帽法

说明书

技术领域

本发明涉及低聚核酸的固相合成法中的加帽(capping)工序。

背景技术

作为制备低聚核酸的方法，一般已知的有固相合成法(非专利文献1)。

固相合成法是通过使被负载于固相载体的低聚核酸衍生物和亚磷酰胺化 合物进行偶联而制备所需链长的低聚核酸的方法，但并不一定亚磷酰胺化合物 与所有的被负载于固相载体的低聚核酸衍生物完全反应。因此，为了用固相合 成法制得高纯度的低聚核酸，必须经过对被负载于固相载体的未反应的低聚核 酸衍生物的5’位羟基进行保护而使其不参与上述偶联反应的所谓的加帽工序。

加帽工序中，作为用于保护低聚核酸衍生物的5’位羟基的酰基化试剂，一 般使用酸酐(例如，乙酸酐、苯氧基乙酸酐)，作为酰基化反应的活化剂，一般 使用例如4-二甲基氨基吡啶(以下称为4-DMAP)或N-甲基咪唑(以下称为 NMI)。

但是，有报道称，作为酰基化反应的活化剂使用4-DMAP时，作为核酸 碱基的鸟嘌呤与4-DMAP反应，鸟嘌呤转变为2，6-二氨基嘌呤(以下称为 2，6-DAP)(非专利文献2)。

非专利文献1：阿格罗沃(Agrawal)等，分子生物学方法：低聚核苷酸及其 类似物的策略(Methods in Molecular Biology：Protocols for Oligonucleotides and Analogs)；Humana Press：Totowa，Vol.20，63(1993)

非专利文献2：斯科特(Scott)等，核酸研究(Nucleic Acids Research)，Vol.17， NO.20，8333(1987)

发明的揭示

另一方面，NMI虽然是目前最常用的酰基化反应的活化剂，但本发明者 在对以下的通式(2)表示的低聚核酸衍生物用苯氧基乙酸酐和NMI实施了加帽 工序后发现，如后述的实施例所示，无法以令人满意的效率在5’位羟基导入苯 氧基乙酰基，其结果是，出现为了获得高纯度的低聚核酸而进行的精制变得繁 杂的问题。

本发明的目的主要是提供在所谓的加帽工序中高效地将核糖的5’位羟基 酰基化的方法。

本发明者进行认真探讨后发现，通过在用酰基保护以下的通式(2)表示的 低聚核酸衍生物的核糖的5’位羟基的加帽工序中，作为酰基化试剂使用以下的 通式(11a)表示的苯氧基乙酸酐衍生物，作为酰基化反应的活化剂使用以下的通 式(11b)或(11c)表示的吡啶衍生物，可高效地制备以下的通式(12)表示的低聚核 糖衍生物，从而完成了本发明。

式(2)、(11a)、(11b)、(11c)及(12)中，各Bx分别独立，表示可具有保护基 的核酸碱基或其修饰体。n表示1～200的范围内的整数，n较好为10～100的 范围内的整数，更好为15～50的范围内的整数。各Q分别独立，表示O或S。 R⁵¹、R⁵²、R⁵³分别相同或不同，表示H、烷基或卤素。R^6a、R^6b、R^7a、R^7b、 R^7c、R^7d分别相同或不同，表示烷基。R^6c、R^6d分别相同或不同，表示H或烷 基。

各WG²表示吸电子基团，各R⁴分别独立，表示H、卤素、烷氧基、烷硫 基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨 基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷基氧基或以下的通式 (3)表示的取代基。

式(3)中，WG¹表示吸电子基团。

E表示酰基或以下的通式(4)表示的取代基。

式(4)中，E¹表示单键或以下的通式(5)表示的取代基。

式(5)中，Q、WG²的含义如前所述。