[发明专利]在活体细胞中筛选配体与受体结合的方法和系统

说明书

技术领域

本发明主要涉及在活体细胞中高通量筛选配体-受体结合的方法和系统。

背景技术

高通量筛选(High-throughputscreening，HTS)研究得益于近年来许多其他技术 的进步。巨型化合物库的合成技术和筛选过程中自动机器人的参与使许多药物开发公司能 够常规地每天筛选大量的化合物。

体外和活体检测中的高通量筛选是评估化合物的重要过程。以细胞为基础的分析 方法，尤其那些利用光学端点的活性筛选方法能研究这些化合物的广泛的功能特征，如特 异性的细胞内生物化学通路、蛋白质间相互作用和靶点的亚细胞定位。组合化学和高通量 筛选与实时药理学的整合是药物发现和开发的重要部分。

G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptors，GPCRs)是细胞表面受体中极为 重要的一类。所有市场上处方药中超过60％的药物都是通过与已知的G蛋白偶联受体相互 作用而发挥作用的，这说明了此类受体在药学上的重要性。成百上千的受体通过异三聚体G 蛋白传递信息，目前已经分离了其中至少17种不同的形式。大多数G蛋白偶联受体由线状7 次跨膜单蛋白链组成。这些受体常被称为7次跨膜受体(seven-transmembranereceptors， STRs)。目前已经发现一百多种不同的GPCRs，包括许多结合同一配体的不同受体，可能还有 更多的GPCRs还未被发现。开发新的药物发现分析方法以鉴定新的GPCRs调控子将会极为有 益。

细胞膜受体蛋白作为治疗性用途靶点是极有价值的。细胞膜受体的例子包括G蛋 白偶联受体和酪氨酸激酶受体(receptorsoftyrosinekinases，RTKs)。细胞膜受体可能 参与了免疫系统调节、自主神经系统信息传递、炎症反应、细胞分化和增殖以及生理感觉如 嗅觉和视觉。

在许多生物活动过程中，配体-受体结合(ligand-receptorbinding，LRB)触发了 一系列细胞信号转导事件的发生。除这些事件外，GPCR蛋白通路的共同特征是一个含有与 配体结合的受体的内吞囊泡的内在化。在许多酪氨酸激酶通路中也能观察到细胞内吞作 用。基于GPCRs和RTKs作为药物靶点的重要性，已经发展了一些研究配体受体结合的细胞内 吞的方法，包括测量细胞膜电容的膜片钳技术(cellmembranecapacitance，Cm)、免疫化 学方法和绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)标记方法。

在GPCRs通路中几乎不存在膜电容测定所需的离子流。免疫化学方法在检测中常 需要大量的细胞，且需耗几十分钟。虽然绿色荧光蛋白标记GPCR蛋白被应用，但存在许多缺 点：1)不能应用于野生型GPCRs；2)GPCR-GFP信号很微弱不能用于检测单个囊泡内吞；3)绿 色荧光蛋白标记可能改变GCPRs自身的某些特性；GFP标记的RTKs的也拥有关于敏感性和基 因工程方面相似的问题。由于GPCRs和RTKs在治疗应用上的重要性，亟待发展能用于高通量 筛选系统中的高敏感性的检测方法。

发明内容

一方面，本发明是关于建立了用于检测配体与细胞膜受体结合并产生内吞的具体 方法，即在单个细胞上检测配体与一种或多种细胞膜受体结合的一种方法，包括用荧光染 料及配体的孵育细胞的步骤；检测内吞囊泡的荧光染料等。

另一方面，本发明涉及配体与细胞膜蛋白结合的筛选系统。一个与本发明相对应 的系统包括自动液体控制装置、x-y方向定位平台、单细胞内吞囊泡成像显微镜及其配套装 置，以及能够控制x-y方向单位步径的操作系统。

本发明的其它方面和优点将会在以下的说明书和权利要求书中进一步说明。

附图说明

图1显示一种配体与GPCR结合后通过GRK引起磷酸化、并与β-抑制蛋白(β- arrestin)结合触发内吞等。

图2A-2B显示细胞FM孵育过程及随后的FM成像结果。

图3A-3B显示在单个DRG神经元上通过FEI方法记录到的ADP引起的内吞现象和柱 状图统计结果。

图4A-4B显示在单个DRG神经元上通过FEI方法记录到的5-HT引起的内吞现象和柱 状图统计结果。

图5A-5B显示在单个DRG神经元上通过FEI方法记录到的NGF引起的内吞现象和柱 状图统计结果。