[发明专利]使用硬骨鱼胚胎筛选具有血管调节活性的试剂的方法

说明书

发明背景

血管发生是一种从现有的血管中形成新血管的生理过程(Risau， 1997)。这个过程正常地仅在生长和发育，以及在对组织恢复血流的 伤口愈合中发生。然而，血管发生的失控是大多数重要疾病，如癌症 和类风湿性关节炎中的常见因素(Liekens等，2001)。这些疾病可能是 由于新血管生长过度或不足所致或者由此发展产生的。血管生长过度 发生在，例如，在癌症中，由于为了形成新的血管用于满足对营养的 过度需求，异常地产生了过量的血管生长因子。在另一个方面，血管 发生不足发生在，例如，在冠状动脉疾病中，由于血管生长因子的产 量不足，使血管不能充分生长，导致组织损伤和死亡。因此，全世界 制药公司都在积极从事针对治疗血管发生失控的疗法。

背景技术和现有技术的描述

虽然存在大量血管发生相关治疗的潜在市场，也很难找到适合用 于评价血管发生反应效果的测定(Staton等，2004)。最常使用的测定 是体外测定，其中在塑料烧瓶中培养的内皮细胞中检验新药。缺点是， 其很难将体外测定中所获得的观察资料推延模拟体内环境中实际所 发生的血管发生的复杂过程(Staton等，2004；Taraboletti和Giavazzi， 2004)。在另一个方面，使用小鼠之类的动物模型的体内测定昂贵、费 时且很难量化(Staton等，2004)。因此，通常使用多种体外测定用于 前导化合物的鉴定，随后将通过一种以上的体内测定验证前导化合物 对血管发生的功效。然而，对于血管发生测定来说，量化仍然是一种 重要的关键参数。理想的定量的血管发生测定的标准(Hasan等，2004) 是，测定应当：

1)提供新形成的血管的结构的定量测量；

2)提供新形成的血管的功能特性的定量测量；

3)能区分新形成的和先前存在的血管；

4)适用于长期研究；

5)是经济的，快速的，容易使用，可重复的；以及

6)不导致任何组织损伤；

到目前为止，现存的体内测定中没有一种真正地满足这些要求 (Hasan等，2004；Taraboletti和Giavazzi，2004)。似乎使用斑马鱼 作为模型的体内药物筛选测定满足理想的定量的血管发生测定的标 准。斑马鱼体内测定具有体外测定(与体外测定相比的高通量 (throughout))和体内测定(是完整的生物体)的优点和便利，以 及因此能用作体外筛选和随后的体内确认之间的桥梁或过滤器 (Epstein和Epstein，2005；Goldsmith，2004；Parng等，2002)。斑 马鱼体内测定将在进入更昂贵的体内确认期前，从体外测定所鉴定的 列表中除去那些具有毒性作用的前导化合物。已经证明斑马鱼体内测 定是一种用于筛选血管发生药物的有用方法(综述见(Kidd和 Weinstein，2003))。例如，Serbedzija和他的同事描述了筛选方法学， 其基于计数在胚胎两侧卵黄表面上所形成的肠下血管的数量 (Serbedzija等，1999)。利用内源性碱性磷酸酶活性对血管进行染色。 已经发展了具有荧光血管的转基因斑马鱼系(Cross等，2003；Lawson 和Weinstein，2002)，使得可极大地简化血管发生的显像和分析。然 而，仍然没有全面描述斑马鱼如何用作血管发生药物开发以及相应的 毒性试验的定量工具的方法和工具。

发明概述

本发明涉及一种使用硬骨鱼胚胎作为模型，筛选具有血管发生调 节活性、并没有表观毒性(apparent toxicity)的试剂的3层次(3-tier) 筛选系统。本发明的3层次筛选系统满足上面所列理想的定量血管发 生测定的标准，并且提供用于鉴定具有最低毒性的血管发生调节剂的 有效的筛选测定系统。该筛选系统由3个分等级的层次构成：1)前 导鉴定；2)一般毒性试验；3)器官特异性毒性试验。本发明优选的 模型是斑马鱼或青鳉(medaka)胚胎。本发明的优点是，其可在第一 层次上迅速鉴定潜在的血管发生调节剂以及然后将这些潜在的血管 发生调节剂分别进行层次2和3安全性检验。因此，前导试剂中通过 所有3个层次的最终候选物将具有期望的血管发生活性，并具有最小 的毒性。