[发明专利]口服施用的短干扰核糖核酸（siRNA）

说明书

背景技术

作为转录后基因沉默(PTGS)而最初发现于植物中的RNA干扰，是 由双链RNA(dsRNA)引起的高度保守的机制，并能够下调与dsRNA¹同源的基因的转录。该dsRNA首先由Dicer加工成21-23核苷酸的短双链 体，其称为短干扰RNA(siRNA)²。合并入RNA诱导的沉默复合体(RISC) 后，它们能够通过由Argonaute2(RISC3的组件)在同源区域的中心切 割靶mRNA从而介导基因沉默。2001年，Elbashir等人⁴证实在果蝇以及 哺乳细胞中直接引入合成的siRNA将介导RNA干扰基因沉默。从那时起， siRNA介导的基因沉默已成为靶标鉴定和靶标确认研究中强大且广泛使用 的分子生物学工具。在动物研究中使用siRNA进行基因沉默已在有限量的 动物模型中有所描述。将未修饰的siRNA在眼中局部递送、在中枢神经系 统中向鞘内或脑内递送、以及鼻内递送用于抑制呼吸病毒⁷。未修饰的 siRNA的静脉内波浪传播尾静脉注射(intravenous hydrodynamic tail vein injection)也已有所研究。该方法允许快速递送，主要是向肝脏⁸。很少研 究报道过未修饰siRNA的全身施用。Duxbury等人⁹经静脉将靶向黏着斑 激酶的未修饰siRNA施用于原位肿瘤异种移植小鼠模型，并观察肿瘤生长 抑制以及对吉西他滨的化学敏感性。Soutscheck等人报道了全身使用高度 化学修饰的siRNA用于内源沉默脱脂载脂蛋白B。以50mg/kg的高剂量 腹膜内施用大多数抗ApoB siRNA降低了ApoB蛋白质水平和脂蛋白浓度。 尽管有这些例子，在体内基于全身递送的siRNA使用仍需要改进以便使该 技术可广泛应用于靶标确认或治疗应用。实际上，未修饰的siRNA主要是 通过血流中丰富的核酸酶来进行酶消化。为了加强siRNA的药物特性，几 个小组研究了这些试剂的化学修饰。而所描述的方法之间大相径庭并且仍 未进行全身性研究，这些结果的概述允许确定siRNA对化学修饰的耐受性。 几种化学修饰例如硫代磷酸酯类¹¹或boranophosphates¹²、2’-O-甲基¹³、 2’-O-烯丙基¹⁴、2’-甲氧乙基(MOE)和2’-脱氧氟代核苷酸类 (2’-deoxyfluoronucleotides)¹⁵或锁定核酸(LNA)¹⁶已有所研究。这些研究突 出显示对修饰的耐受性不仅是化学依赖性的，而且是位置依赖性的。

本发明提供了具有改进的药物特性的最低程度修饰的siRNA。这些最 低程度修饰的siRNA是19bp双链RNA，其在每条链的3’-末端经修饰以 防止3’-外切核酸酶消化：21-nt siRNA的3’-双脱氧核苷酸突出端已由通 用的3’-羟丙基磷酸二酯部分所替代，且每条链的3’-末端前两个碱基配对 核苷酸的修饰进一步增强了血清稳定性。经腹膜内或口服施用于成年小鼠 后，修饰的siRNA在生长因子诱导的血管发生模型中显示出更高的效力， 这与其增加的血清稳定性相关。

发明概述

在一方面，本发明提供了用于口服施用的短干扰核糖核酸(siRNA)， 所述siRNA包含两条单独的RNA链，它们在至少15个核苷酸上是互补的， 其中每条链有49个核苷酸或更少，并且其中至少一条链含有至少一个化学 修饰。

在一项实施方案中，siRNA包含至少一个修饰的核苷酸。

在另一实施方案中，siRNA包含至少一个3’末端帽。

在另一实施方案中，所述修饰的核酸选自2’烷氧基核糖核苷酸、2’烷 氧基烷氧基核糖核苷酸、锁定核酸核糖核苷酸(LNA)、2’-氟代核糖核苷 酸、吗啉代核苷酸。

在另一实施方案中，所述修饰的核苷酸选自具有修饰的核苷间键合的 核苷酸，所述核苷间键合选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、 硼烷膦酸酯(boranophosphonoate)和酰胺键合。

在另一实施方案中，所述两条RNA链彼此间是完全互补的。

在另一实施方案中，所述siRNA在5’末端或3’末端中至少一端上包含 1至6个核苷酸突出端。