[发明专利]与突变麦芽糖结合蛋白融合的靶蛋白的溶解和纯化

说明书

背景

[0001]当需要大量纯蛋白时，重组蛋白在生物技术中具有多种用 途。微生物表达系统，如大肠杆菌(E.coli)和酵母通常是第一选择， 这是由于它们的低成本和高产率。当在大肠杆菌中表达异种蛋白时， 通常碰到蛋白的低水平表达和/或不溶的问题。即使蛋白充分表达并保 持可溶，其必须从细胞提取物的大量其它蛋白中纯化。要促进靶蛋白 的表达和纯化，通常使用的一种方法是对该蛋白融合亲和标记。好的 亲和标记具有这样的性质——当融合到靶蛋白的N-末端时，其促进高 水平表达，并提供简单的一步亲和纯化，其允许靶蛋白从表达环境中 被纯化。

[0002]大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白(MBP)通常被用作表达和纯 化大肠杆菌中产生的异种蛋白的亲和标记。MBP的天然功能是在外膜 孔蛋白结合麦芽糖糊精并在内膜将其释放到MalEFK转运元件 (transport apparatus)。MBP的C-末端与靶蛋白的N-末端融合允许融 合蛋白在大肠杆菌中表达(图1)。MBP和MBP融合体(fusion)可以 通过结合到色谱基质而在一步内被纯化，所述色谱基质含有大量葡萄 糖α-1→4-葡萄糖多糖中任意一种，如直链淀粉、淀粉或其它麦芽糖糊 精(美国专利5,643,758)。许多在其天然宿主(native host)中可溶的 蛋白当作为重组蛋白表达时不溶解。对于这些蛋白中的许多种来说， 与MBP融合使它们可溶(Kapust & Waugh，Protein Sci.8：1668-74 (1999))。

[0003]MBP作为亲和标记的用途被这样的事实减弱——取决于 MBP-靶蛋白纯化中的蛋白，一些融合体既不能结合到亲和基质又不能 结合到其它。此外，非离子去污剂的存在，如Triton X100和Tween 20 会干扰结合，特别对于具有固有较低亲和性的MBP-靶蛋白融合体。

[0004]研究人员已经使用MBP的结构制备定向突变，以便改变 MBP的结合特性。MBP的X射线晶体结构已经由Spurlino等，J.Biol. Chem.266：5202-5219(1991)报道。MBP包含两个结构域，在多糖结合 的结构域之间具有一个裂(cleft)。包含N-末端的结构域被称为N结构 域，而包含C-末端的结构域被称为C结构域。三个环跨在这两个结构 域之间，形成铰链区(hinge)。两个小组已经使用该结构在铰链区后面 的区域进行定向突变，提高了MBP对麦芽糖和麦芽三糖的亲和性 (Marvin等，Nature Structural Biology8：795-798(2001)；Telmer& Shilton，Journal of Biol.Chem.278：34555-34567(2003))。然而，该方法 具有固有的缺点，因为对MBP的修饰提高了该蛋白表面的疏水性并因 此降低了其溶解性。这通过增大其使融合蛋白不溶的倾向而减小了其 作为亲和标记的用途。

概述

[0005]在本发明的一个实施方式中，提供了修饰的MBP融合蛋 白，其由具有突变的MBP氨基酸序列表征，其中所述突变使修饰的 MBP融合蛋白具有至少一种选自下列的特性：(i)提高的对麦芽糖糊精 底物的亲和力及(ii)当与具有有限溶解性的靶蛋白融合时，提高的溶解 性。在本发明的又一实施方式中，修饰的MBP具有突变，其位于螺旋 XI和XII之间的铰链区，或在该蛋白A313的的区域内。例如， 突变可以位于C结构域或在S146的的区域内——在该蛋白的β- 折叠F的开端。该修饰具体可以是A313V或S146T。

[0006]在本发明的又一实施方式中，修饰的MBP可以与靶蛋白融 合形成融合蛋白，并且可以，例如具有比与靶蛋白融合的未修饰MBP 蛋白的溶解度更高的溶解度。

[0007]在本发明的一个实施方式中，修饰的MBP可具有选自SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列或编码该蛋白的DNA序列，所 述DNA序列选自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5。DNA可以被插入载 体，如pKLAC1载体，用于在诸如克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或 大肠杆菌的宿主细胞中表达。