[发明专利]用于诱导外显子跳跃的手段和方法

说明书

技术领域

本发明涉及寡核苷酸及其等同物以及将它们用于诱导外显子 从mRNA中去除的应用。

背景技术

近年来，反义技术已经得到相当大的发展。反义技术的一般领 域可分为若干方面。这些方面之一是外显子跳跃领域。

在该领域中，向细胞中加入小分子从而特异地干扰信使RNA (mRNA)的剪接，并且更具体地，干扰成熟的mRNA中的特定外 显子的结合，或者更准确地说是成熟的mRNA中的特定外显子结合 不足。

在外显子跳跃领域中，可以区分为两种一般方法。一种方法集 中在干扰剪接(即，外显子序列的物理连接)的酶促过程。另一种 方法依赖于干扰剪接过程的“逻辑学”(logistics)，即干扰通过剪接 机制对外显子的识别。两种方法均使用小分子来获得所需的效果。 该小分子都共有核酸分子能够“杂交”至互补序列的特性。这样的 小分子的实例当然是RNA和DNA、以及修饰的RNA和DNA(如 LNA和吗啉代化合物(morpholinos)、以及诸如PNA的核酸模拟 物)。这些分子进一步被称为通用术语“小分子”或更加经常使用 的术语“反义寡核苷酸(AON)”。

小分子被认为是通过杂交至pre-mRNA(前体mRNA)的特定 位点而发挥作用的。杂交被认为干扰剪接的酶促过程或者外显子的 识别。

目前，外显子跳跃集中在将一种或多种外显子从成熟的mRNA 中特异性去除。然而，使剪接机制改变方向从而将其他的外显子包 括在mRNA中也是可能的。例如，这种方法可应用在进行选择性剪 接的基因中。在这些情形下，可将小分子设计为使剪接机制改变方 向，以便更加有效地形成具体的可选择方案(specific alternative)。

发明内容

在本发明中，已经发现外显子跳跃过程能够变得更加有效。许 多关于外显子跳跃的早期研究是使用针对抗肌萎缩蛋白基因中外 显子跳跃的AON而进行的。迄今为止，我们已经识别了一系列的 114个外显子-居间AON(exon-internal AON)，它们在培养的肌细 胞中诱导35个外显子的跳跃(14)。我们的数据表明，有效的外显 子-居间AON可能是通过对富含丝氨酸/精氨酸的(SR)蛋白家族 成员结合至外显子剪接增强子(ESE)位点的空间位阻而发挥作用 的(15)。SR蛋白结合至外显子序列移动(exon sequence motive) 并集结其他的剪接因子以介导剪接作用(19)。对于我们所研究的 多数外显子而言，单个ESE的AON-靶向(AON-targeting)足以诱 导显著水平的外显子跳跃(14)。然而，对于一些外显子而言，跳 跃效率低至0。在本发明中，我们证实了通过用两个或多个外显子 居间AON来靶向外显子可以提高跳跃水平。为此目的，本发明提 供了一种用于确定在产生含所述mRNA前体的外显子的细胞中是 否能提高从成熟的mRNA中去除外显子的效率的方法，

所述方法包括：

为所述细胞提供能够杂交至所述外显子的外显子居间部分的 第一反义寡核苷酸(AON)，并在为所述细胞提供能够杂交至所述 外显子的另一外显子居间部分的第二AON后，确定所述效率是否 得到提高。优选通过与每一种单独AON的效率比较水平来确定效 率的提高。本文使用的术语“提高的效率”是指这样的情形，其中 (i)去除了靶标外显子的mRNA的量高于每一种单独AON，或(ii) 在所述细胞中能够检测靶标外显子的去除的时间间隔增加，或(iii) 二者的结合。与使用单个AON的外显子跳跃方法相比，本发明的 方法还提供了额外的稳健性。因此，本发明进一步提供了一种用于 在由细胞产生的pre-mRNA中诱导外显子跳跃的方法，该方法包括 为所述细胞提供至少两个能够杂交至所述pre-mRNA上外显子的不 同外显子居间部分的AON，并培养所述细胞以允许所述pre-mRNA 进行剪接。