[发明专利]由纤维素、热纤梭菌细胞以及由这些细胞表达的纤维素酶形成的三元复合物介导的水解纤维素的方法

说明书

相关申请

本申请要求2006年5月1日提交的美国临时专利申请第 60/796,635号的优先权的权益，通过引用将其并入本文。

政府权益

美国政府在本发明中可享有一定的权利，因为与其开发有关的研 究是由国家标准与技术研究院(NIST)60NANB1D0064号合同以及能 源部DE-FG02-02ER15350号合同资助的。

发明背景

纤维素类生物质代表廉价且易得的资源，其可发酵以产生乙醇或 其它产品。在生物转化产品中，因为乙醇可作为能够在可持续性、安 全和农村经济发展方面提供益处的可再生民用燃料而产生，因此乙醇 得到很高的关注。

在生物转化法力争变得与石油燃料工艺有经济竞争性时，其面临 与纤维素水解为单糖有关的挑战。与克服纤维素类生物质的顽拗性相 关的工序通常是成本最高的，并且对于R&D驱动的改善具有最大的潜 力。通常通过酸的预处理然后由纤维素酶对预处理的纤维素进行酶性变 质来克服纤维素的顽拗性。目前纤维素酶的成本估计为$0.30至$0.50/ 加仑乙醇。由于酶的成本作为由纤维素类生物质产生乙醇的限制因素， 降低产生乙醇所需纤维素酶的量的任何方法仍然是重要的商业目标。因 此，在过去已努力去了解多组分纤维素酶体系的作用方式并努力改善其 效力。

能够通过在细胞不存在的情况下起作用的纤维素酶、通过在细胞存 在但没有细胞酶的附着材料的情况下起作用的纤维素酶、或通过附着于 细胞的纤维素酶来介导酶的水解。在较后的情况下，由三元的纤维素-酶- 微生物(CEM)复合物介导水解，而不是二元纤维素-酶(CE)复合物。

已知好氧性微生物的细胞并不附着(或仅很弱地附着)于纤维素。因 此，在好氧性体系中纤维素水解的主要试剂是与纤维素结合以形成二元 CE复合物的纤维素酶。这些CE复合物的特征是分别起作用的、功能独 特的蛋白。相反，大部分厌氧性微生物与纤维素附着，并且纤维素水解 的主要试剂为三元CEM复合物，在很多但不是所有情况下涉及“纤维小 体”，其中多种功能独特的蛋白协同作用。

在文献中已观察到并评价了CE复合物组分之间的协同现象，其中由 两种或多种组分组合实现的速率高于当组分分别起作用时观察到的速率 的总和。然而，先前并未评价和量化CEM复合物的“酶-微生物”的协 同作用。

发明概述

本文报导的手段通过提供降低完成给定量生物质的水解所需酶的 量的方法、或者增加可通过给定量的酶而水解的生物质的量的方法而 发展了该技术。

在一实施方案中，使用降低的纤维素酶负荷以水解纤维素底物的 方法包括：确定在一段时间内接近完全地水解一定量纤维素底物所需 的纯化的纤维素酶的量；将纯化的纤维素酶的量降低2至5倍，从而 确定降低的纤维素酶负荷；以及在合适的条件下以及足以使所述纤维 素底物接近完全水解的一段时间将表达与所述降低的纤维素酶负荷浓 度相同的细胞结合纤维素酶的微生物引入所述纤维素底物。

在一实施方案中，使用降低的纤维素酶负荷以水解纤维素底物的 方法包括：确定在一段时间内接近完全地水解一定量纤维素底物所需 的纯化的纤维素酶的量；将纯化的纤维素酶的量降低2至5倍，从而 确定降低的纤维素酶负荷；以及将已设计为表达发酵剂结合纤维素酶 的发酵剂在合适的条件下以及足以使所述纤维素底物接近完全水解和 发酵的一段时间引入所述纤维素底物，其中所述细胞结合纤维素酶与 所述降低的纤维素酶负荷的浓度相同。

附图的简要说明

图1示出纤维素被微生物利用，其中水解是由CEM和CE两种复 合物介导的。

图2示出在涉及CE复合物的同步糖化和发酵(SSF)反应期间纤维 素的酶水解。

图3表示图1所示的试验中经过一段时间后的pH与产物浓度的 变化。

图4表示图2所示的试验中经过一段时间后的pH与产物浓度的 变化。

图5示出图1和图2中所示的微生物和SSF试验以及对照试验的 纤维素浓度曲线。

图6示出不含细胞的对照1的纤维素水解和产物积累。

图7示出在0.064g/L纯化的热纤梭菌(C.thermocellum)纤维小体存 在下通过热解糖热厌氧杆菌(T.thermosaccharolyticum)的微晶纤维素 (Avicel)的连续SSF的纤维素水解和产物积累。