[发明专利]基于测定γ-分泌酶Aβ切割产物的比值诊断阿尔兹海默病的方法

说明书

本发明涉及一种用于诊断阿尔兹海默病(AD)或疾病特定阶段的 方法，该方法基于测定Aβ48、Aβ45、Aβ42、Aβ38和Aβ35中至少两 种γ-分泌酶切割产物的比值，优选测定Aβ38和Aβ42的比值。Aβ38 和Aβ42的比值与其正常比值减小表明患阿尔兹海默病。本发明还提 供了适用于实施所述诊断方法的试剂盒。

为诊断阿尔兹海默病(AD)并将其与其它痴呆症区别开来，人们采 用了各种方法。这些诊断方法包括为使脑部异常可视化，使用计算机 断层扫描(CT)、核磁共振成像(MRI)或正电子放射断层扫描(PET)“扫 描”脑部。另一种诊断方法是细微精神状态检查(MMSE)，它以特定 的认知问题(短期记忆、长期记忆、重复试验)试验为基础，因此， 可以对患者解决问题的能力、语言认知能力等作出不同的评价。熟悉 各种痴呆症的神经病学家、老年医学专家和精神病学家认为该实验可 以做出精确的诊断。因此细微精神状态检查成为当前诊断的基础。

另一种诊断方法是基于利用选择性试验室实验，测定体液例如血 液、溶液、尿等中的疾病特有的化合物(生化标记物、生物标记物)。 这种方法可以测定疾病引起的浓度变化-甚至在疾病的早期，那时临 床症状可能较轻并且不明显。然而该实验存在问题，因为为了早期诊 断并且准确地将阿尔兹海默病与其他痴呆区分开来，必须选择性地检 测低浓度的生化标记物。为了增强诊断的精确性，采用特定的生化标 记物如β-淀粉样蛋白和tau蛋白。tau蛋白在微管脑脊髓液(CSF)水平 被认为能反映神经元和轴索变性或者能够形成神经纤维纠结。因此， tau蛋白被认为是神经元功能障碍(Creutzfeldt-Jacob、阿尔兹海默病 等)的通用生物标记物。在阿尔兹海默病以及其他的神经退行性疾病 中tau蛋白水平适度升高(在克雅氏病中显著升高)，其中在阿尔兹 海默病中磷酸化tau蛋白显著升高。

当前，淀粉样β蛋白(Aβ)被认为是最重要的诊断参数，因为 这种肽是形成脑部斑块如外细胞沉积物(淀粉样变性病)的原因，该 斑块是阿尔兹海默病早期的典型症状。淀粉样前蛋白1型跨膜(TM) 蛋白，经历数种分泌酶蛋白水解过程。首先，淀粉样前蛋白的胞外区结 构域主体需要由膜结合α-或β-分泌酶切除，产生分泌形式的淀粉样前 蛋白和相应的膜结合的α-或β-细胞毒素因子的C-末端片段。由γ- 分泌酶引起的β-细胞毒素因子的调节膜内蛋白水解(RIP)仅在外功能 区脱落之后发生并从膜中释放出Aβ肽。活性γ-分泌酶复合物由四种 亚基即早老因子(PS-I)、APH-I、PEN-2和nicastrin组成。早老因子 在跨膜序列(TMS)-6和跨膜序列(TMS)-7中含有两个催化活性的天门 冬氨酸残基。PS-1是蛋白内切割，它的N端和C端片段在γ-分泌酶 的催化核心中以二聚体形式存在。细胞毒素因子N端通过nicastrin 识别，其作用为γ-分泌酶底物受体。γ-分泌酶在不同的位点切割， 因此产生不同长度的β肽。由于Aβ肽蓄积形成淀粉样蛋白斑因而与 阿尔兹海默病紧密相关。β类中Aβ42是病理学上最相关的形式，因 为它更易于聚集并且据发现在阿尔兹海默病患者脑中水平升高。

最近讨论的γ-分泌酶切割机理暗示以连续的蛋白水解步骤释放 蛋白。因此，最先的切割发生在跨膜序列(TMS)细胞质边缘，在ε位 点，即β-细胞毒素因子的第49位残基。产物Aβ49仍然与膜结合并 且在连续作用方式中进一步加工得到Aβ46(ζ-位点)和Aβ40或Aβ42 (γ-位点)(图IA)。近来报道了通过一种类似的连续机理由γ-分泌 酶对Notch(凹口)进行加工。之前的研究显示淀粉样蛋白形成同类 二聚体，因为已经观察到它可作为其他的γ-分泌酶底物，例如受体 酪氨酸蛋白激酶ErbB-4和E-cadherin。淀粉样前蛋白的同类二聚体形 成可能由细胞外区域两个不同的位点介导，第一个位点是包含残基 91-111的环区，第二个位点是与胶原结合位点重叠的包含残基 448-465的片段。