[发明专利]寡肽的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从含有寡肽及中性氨基酸的溶液中分离·纯化寡肽的方法。

背景技术

作为制造寡肽的方法，例如已知(a)使用来自枯草杆菌的肽合成酶由无保护的L-氨基酸进行制造的方法(参见非专利文献1)、(b)使用具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的酶或含酶物质由L-氨基酸酰胺及L-氨基酸进行制造的方法(参见专利文献1)、(c)使用具有生成二肽活性的蛋白质由L-氨基酸酯及L-氨基酸进行制造的方法(参见专利文献2～4)、(d)使用氨基酸酯水解酶进行制造的方法(参见专利文献5)、(e)使用由属于稳杆菌属(empedobacter)的细菌得到的酶进行制造的方法(参见专利文献6～9)等。另外作为上述(a)的例子，还已知(f)在含有葡萄糖及铵盐的培养基中，在基质氨基酸存在下，培养表达来自枯草杆菌的二肽合成酶基因ywfe及丙氨酸脱氢酶基因ald的大肠杆菌，生成二肽的方法(例如参见专利文献10)等。进而已知(g)通过化学合成进行制造的方法(参见非专利文献2)、在上述(a)～(f)的方法中组合化学合成的方法进行制造的方法等。在所述方法中，必须分离生成的寡肽和残留的杂质(例如基质等)。特别是在使用酶的制造方法(例如上述(a)～(f))中，生成的寡肽和基质的分离经常成为问题。

作为生成的寡肽与基质氨基酸的分离纯化方法，例如已知利用凝胶色谱法、亲和色谱法、使用合成吸附树脂的色谱法、高效液相色谱法等各种色谱法的分离纯化方法，通过将生成的寡肽进行结晶的纯化方法等(例如参见非专利文献2)。但是，在利用色谱法的纯化方法中，对载体及溶剂的选择通常需要进行充分研究，另外经常难以进行令人满意的纯化。进而，通常用作载体的合成吸附树脂等价格较高，不适合大规模的商业生产。另外，在结晶纯化法中，从含有中性氨基酸的粗产物中分离·纯化寡肽的情况下，例如在含有亮氨酸等溶解度低、结晶性良好的氨基酸时，有时难以除去该氨基酸。

还已知采用使用比较便宜的离子交换树脂的离子交换色谱法的纯化方法(例如参见非专利文献2～4等)。但是，在以等电点明显不同的酸性氨基酸和碱性氨基酸作为基质制备的寡肽的分离纯化中，因为能够仅使该氨基酸吸附于强酸性阳离子交换树脂上和强碱性阴离子交换树脂上，故而有效[例如已知将含有亚氨基二羧酸及甘氨酸的水溶液用弱碱性阴离子交换树脂处理，使酸性物质亚氨基二羧酸吸附于树脂来分离甘氨酸的方法(参见专利文献11)]，但由等电点相近的中性氨基酸构成的寡肽与该中性氨基酸的分离较难。

另一方面，已知(1)将含有数种氨基酸的中性水溶液用弱酸性阳离子交换树脂处理，使碱性氨基酸吸附于树脂，用盐酸进行洗脱，由此分离碱性氨基酸的方法(参见专利文献12)；(2)使从鲣鱼汤中得到的含有碱性氨基酸的鹅肌肽(N-β-丙氨酰-L-1-甲基-组氨酸)及肌肽(N-β-丙氨酰-L-组氨酸)吸附于弱酸性阳离子交换树脂上，用氨洗脱，由此分离·纯化鹅肌肽和肌肽的方法(参见专利文献13)。所述方法利用碱性氨基酸或含有碱性氨基酸的二肽吸附于该弱酸性阳离子交换树脂上的性质。

专利文献1：国际公开第2003/010187号说明书

专利文献2：国际公开第2003/010189号说明书

专利文献3：国际公开第2003/010307号说明书

专利文献4：特开2005-040034号公报

专利文献5：特开2005-168405号公报

专利文献6：特开2005-269905号公报

专利文献7：国际公开第2004/011652号说明书

专利文献8：国际公开第2004/011653号说明书

专利文献9：国际公开第2004/022733号说明书

专利文献10：国际公开第2006/001379号说明书

专利文献11：特开2005-298366号公报

专利文献12：美国专利第2549378号说明书

专利文献13：特公平第6-93827号公报

非专利文献1：《Fine Chemical》平成17年6月号，CMC出版，2005年，vol.34No.6，p.25～35

非专利文献2：《肽合成的基础和实验》，丸善株式会社，泉屋信夫、加藤哲夫、青柳东彦、胁道典著，1985年

非专利文献3：《生物化学实验指导2蛋白质的分离·分析法》，化学同人，泉美治、中川八郎、三轮谷俊夫共同编著，1985年，p.1～20

非专利文献4：《Diaion I基础篇(第18版)》，三菱化学株式会社离子交换树脂事业部，平成15年11月1日，p.15