[发明专利]细胞生长培养基

权利要求书

1.在无细胞饲养层和无血清的细胞培养条件下维持灵长类胚胎 干细胞的方法，所述方法包含：在包含细胞培养基的细胞培养容器中 形成灵长类胚胎干细胞制备物，以及维持灵长类胚胎干细胞处于未分 化状态，所述细胞培养基含有成纤维细胞生长因子、肝素以及抗坏血 酸或抗坏血酸磷酸盐或其衍生物。

2.在无细胞饲养层和无血清的细胞培养条件下维持灵长类胚胎 干细胞的方法，其包含如下步骤：

i)在由基于蛋白质的细胞培养支持物包被的细胞培养容器中形成 灵长类胚胎干细胞制备物，其中将所述细胞培养于细胞培养基中，所 述细胞培养基包含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、2-巯基乙醇、 与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸，且其中所述细胞培养基还补充 有成纤维细胞生长因子、肝素以及抗坏血酸或抗坏血酸磷酸盐或其衍生 物；以及

ii)维持灵长类胚胎干细胞处于未分化状态。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述灵长类胚胎干细胞具有 稳定的核型。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中抗坏血酸为抗坏血酸 磷酸盐。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述灵长类胚胎干细 胞为多能人胚胎干细胞。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述灵长类胚胎干细 胞在整个细胞培养过程中保留了分化成至少内胚层、中胚层以及外胚层 组织的特性。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中成纤维细胞生长因子 (FGF)选自aFGF、bFGF、FGF-4、FGF-9、FGF-17或FGF-18。

8.如权利要求7所述的方法，其中以1-100ng/ml的浓度提供成纤维 细胞生长因子。

9.如权利要求8所述的方法，其中以约10ng/ml的浓度提供成纤维 细胞生长因子。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述成纤维细胞生长 因子为bFGF。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中成纤维细胞生长因 子是重组的。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中以0.01-0.2mg/ml 的浓度提供抗坏血酸或抗坏血酸磷酸盐或其衍生物。

13.如权利要求12所述的方法，其中以约0.1mg/ml的浓度提供抗坏 血酸或抗坏血酸磷酸盐或其衍生物。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中以0.1-1.0mg/ml的 浓度提供2-乙醇胺。

15.如权利要求14所述的方法，其中以约0.6mg/ml的浓度提供2- 乙醇胺。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中以3-15μg/ml的浓 度提供油酸。

17.如权利要求16所述的方法，其中以约9.5μg/ml的浓度提供油酸。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中以10-500ng/ml的 浓度提供肝素。

19.如权利要求18的方法，其中以约100ng/ml的浓度提供肝素。

20.如权利要求18或19所述的方法，其中肝素为肝素钠。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述蛋白质细胞培 养支持物是基于胶原蛋白的。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述基于胶原蛋白的细胞培养 支持物包含I型胶原蛋白。

23.如权利要求22所述的方法，其中I型胶原蛋白为重组的I型胶 原蛋白。