[发明专利]细胞生长培养基

说明书

本发明涉及灵长类胚胎干细胞，优选人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hES)在无饲养层细胞和无血清的培养中的维持。

培养例如某些哺乳动物细胞的胚胎细胞已成为常规的方法，且允许 某些细胞增殖的细胞培养条件也有详细说明。通常，哺乳动物细胞的细 胞培养需要通常由塑料制成的无菌容器和生长培养基。例如，胚胎干细 胞的生长需要饲养层细胞和血清两者的存在。饲养层细胞的功能还未明 确了解。但据推测，饲养层细胞的作用可能是提供促有丝分裂信号，该 信号刺激细胞增殖和/或保持细胞的未分化状态。饲养层细胞通常是经过 处理(如丝裂霉素或辐射处理)以致不能增殖的成纤维细胞。通常，饲养层 成纤维细胞是鼠源的，但也可来自其他物种。

术语“干细胞”是一群未分化细胞的总称，所述未分化细胞具有自我 更新的能力，同时保留了形成分化的细胞和组织的多样化潜能。干细胞 可以是全能的(totipotent)、多能的(pluripotent)或专能的(multipotent)。也存 在丧失分化能力的衍生干细胞，被称为“无能(ullipotent)”干细胞。全能 干细胞是能够形成在完整的生命体中发现的所有细胞和组织包括胚胎外 组织(即胎盘)的细胞。全能干细胞包括极早期胚胎(8个细胞)，并能够形 成完整的生命体。尽管多能干细胞不能形成完整的生命体，但多能干细 胞是具有形成在完整生命体中发现的所有组织的能力的细胞。专能干细 胞具有形成分化的细胞和组织的有限能力。通常，成体干细胞是专能干 细胞，并且是能够形成某些细胞或组织并补充老化或受损的细胞/组织的 前体干细胞或祖系限定干细胞(lineage restricted stem cells)。尽管对于此类 “成体”干细胞，有些报道声称其比最初预料的具有更强的潜能，但它们 通常不能形成生命体中发现的所有组织。

多能胚胎干细胞主要来自两种胚胎来源。分离于内细胞团的细胞称 为胚胎干(ES)细胞。在实验小鼠中，类似的细胞可从原生殖细胞的培养物 中获得，原生殖细胞分离自交配后8.5至12.5天的胚胎的肠系膜或生殖 脊。它们被称为胚胎生殖细胞(EG细胞)。这些类型的多能细胞的每一种 都具有类似的分化成其他细胞类型的发育潜能，但习性(如印记)中可能的 差异又使这些细胞彼此不同。但术语“多能胚胎干细胞”包括来自内细胞 团的细胞和原生殖细胞两者。

已证明，建立灵长类胚胎干细胞的体外培养物尚存疑难。 WO96/22362中记载了确定允许建立培养的hES细胞的条件的指标。 WO96/22362描述了允许灵长类ES细胞连续增殖的细胞系和生长条件， 所述的灵长类ES细胞表现出了一系列与具多能特性的干细胞有关的特 性或标志物。这些包括，但不限于，当维持于成纤维细胞饲养层中时， 在培养物中维持至少20代；产生被称为拟胚体的成簇的细胞；当培养于 悬浮液中时，能在单细胞层培养中分化成多种细胞类型；当注射入免疫 缺陷小鼠中时，形成具有多种分化的细胞类型的异种移植畸胎瘤以及表 达胚胎干细胞特异性标志物，特别是SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA- 1-81、碱性磷酸酶以及Oct4。WO96/22362公开了在小鼠成纤维细胞饲养 层细胞和血清存在的情况下，维持培养的灵长类ES细胞处于未分化状态 的方法。

已有大量资料证明了胚胎干细胞，特别是人ES(hES)细胞在治疗型 组织工程中潜在的效用。这些细胞的多能特性允许选择hES细胞并使hES 细胞分化成任何细胞/组织类型。然而，当治疗中使用暴露于胎牛血清或 鼠饲养层细胞的细胞时，存在诸如阮病毒或病毒的外源因子可能感染受 体的潜在风险。因此，必须处理hES细胞的细胞培养，以使这种风险降 至最低。无饲养层和无血清的条件的研发，将有助于降低这种风险。

此外，已分化成特定细胞类型衍生物的hES细胞，因为其在基因分 型上相同、稳定且来源已知，故可用于鉴定新药物和现有药物的基因靶 标。使用不同基因型的ES细胞系也在药物基因组学相关的方面为药物筛 选和毒理学提供了可能的途径。