[发明专利]免疫抑制药物的同质双重受体凝集测定法

说明书

发明领域

本发明涉及治疗药物监测领域，尤其是涉及测定样品中免疫抑制药品的存在或其含量的免疫测定法。更特别的是，本发明涉及用于测定免疫抑制药物的同质(homogeneous)非竞争性的双重受体测定法。

背景技术

有几种重要的作用于亲免素的免疫抑制药物，如环孢菌素、他克莫司、雷帕霉素和依维莫司。亲免素是具有肽基脯氨酰异构酶活性的蛋白质伴侣蛋白，其属于结合环孢菌素的亲环蛋白(CyPs)和FK506结合蛋白(FKBPs)两个大家族的其中之一。

环孢菌素(也被称为环孢素和环孢霉素A)是土壤真菌的天然代谢产物，是由11个氨基酸组成的肽，与他克莫司一起，是钙调神经磷酸酶抑制剂。环孢菌素被认为与免疫活性淋巴细胞(特别是T淋巴细胞)的细胞溶质蛋白亲环蛋白(一种亲免素)结合。这种环孢菌素和亲环蛋白的复合物可以抑制在常态环境下诱导白细胞介素2转录的钙调神经磷酸酶。这种药物还抑制淋巴因子的产生和白细胞介素的释放，从而导致效应T细胞的功能减退。

他克莫司(FK506)也是真菌产物(Streptomyces tsukubaensis)。它是大环内酯而且通过抑制钙调神经磷酸酶起作用。这种药物尤其用在肝脏、肾脏、心脏以及肺的移植。它与亲免素结合，接着复合物与钙调神经磷酸酶结合且抑制其磷酸酶的活性。以这种方式，它阻止了G0期转入到G1期。他克莫司比环孢菌素效力更强且显著副作用更少。

雷帕霉素(西罗莫司)是非常强效的免疫抑制药物。它与FKBP 12(12kDa的FK504结合蛋白)形成紧密的复合物，而且雷帕霉素-FKBP12复合物再依次与哺乳动物的雷帕霉素靶(mTOR)或者酵母的雷帕霉素靶(yTOR)结合。有两种yTOR的形式，yTOR1和yTOR2。作为新的磷脂酰肌醇激酶相关的激酶家族中的一员，mTORs激酶的活性是其信号传导功能所必需的。在mTOR中，FKBP12-雷帕霉素的结合域(FRBD)被鉴别为位于激酶域氨基末端上的11kDa的片段。

尽管环孢菌素与他克莫司(FK506)的分子结构不同，它们的免疫抑制特性和分子机制是相似的。两者均与丰富的细胞溶质蛋白即亲免素胞内结合。至于他克莫司，主要的结合蛋白看来为FKBP12，而环孢菌素与一族名为亲环蛋白的亲免素结合。然后这种药物-亲免素复合物可以和钙调神经磷酸酶、钙调节蛋白以及钙形成五聚体复合物，引发钙调神经磷酸酶-磷酸酶活性的非竞争性的抑制。

依维莫司是免疫抑制的大环内酯，其在西罗莫司结构上的C-40位具有稳定的2-羟乙基链。依维莫司比西罗莫司具有较大的极性，是在改良西罗莫司的药物代谢动力学特性的工作中开发出来的。

钙调神经磷酸酶(CaN)是异二聚体蛋白质磷酸酶，它由61kDa催化亚基A(CaNA)和19kDa调节亚基B(CaNB)所组成。已知的，他克莫司(FK506)对于CaN酶活性的抑制作用主要是通过FKBP12介导的。事实上FK506/FKBP12复合物在钙离子存在的情况下，高亲和力的与CaN结合，从而可能开发出定量检测血液样品中他克莫司的双受体“夹心”测定法。

因为晶体结构分析显示的CaN A和CaN B均有助于与FK506-FKBP12复合物相结合时界面间的相互作用，理想的融合应该跨这两个亚基。近来，报道了97kDa单链融合钙调神经磷酸酶A/B-钙调节蛋白(scCN)多肽的表达和纯化(Y.Qin et al，Biochimica et Biophysica Acta，1747，171-178，2005)。尽管这暗示了单链的CaN-CaM可能表现出磷酸酶的活性，但是是否具有与FK506-FKBP12复合物结合的能力仍没有被确认。另外，这种97kDa scCN的表达水平非常低。在为了产生体积较小且容易操纵的蛋白质的努力下，Schreiber和他的同事公开了被截短的CaN融合物的产生。在这种融合物中，为了能表达功能的CAB(fCAB)，CaNA的氨基酸12-394与整个CaNB的氨基末端融合。相似的，也构建了名为最小CAB(mCAB)的较短版本，其涵盖CaNA的氨基酸340-394和整个CaNB。这些fCAB和mCAB与FK506-FKBP12复合物结合的活性是由瞬时转染的Jurkat T细胞的转录报告测定所指示出的(P.demons et al，Chemistry & Biology，9，49-61，2002)。然而至此就没有更深入的关于fCAB和mCAB的表达和纯化以直接确定在体外与FK506-FKBP12的相互作用的研究被公开。