[发明专利]促红细胞生成素组合物

说明书

本申请要求2006年5月19日提交的美国临时申请60/801,688和 2007年3月07日提交的美国临时申请60/905,770的权益。

发明领域

本发明涉及分子生物学领域，详细地讲，本发明提供用于制备具 有所需N-糖形的PEG基化促红细胞生成素的均质组合物的材料和方 法。

发明背景

重组体糖蛋白的生产已经是生物技术工业很活跃的一个领域。重 组体糖蛋白的一个缺点已经是通常使用的细胞宿主例如CHO细胞所 产生的糖基化的不均一性。相反，本发明提供已经被工程改造成生产 包含预选的所需N-聚糖结构的重组促红细胞生成素的低等真核宿主 细胞。因此生产的重组促红细胞生成素的组合物在糖形的均匀度方面 显著大于在CHO细胞中生产的那些促红细胞生成素。

促红细胞生成素是已经广泛地用于需要增加红细胞生成的治疗 适应症包括肾衰或化学治疗引起的贫血的蛋白质激素。因为对安全和 有效的促红细胞生成素的巨大需求，重组人促红细胞生成素已经成为 销售量最大的重组人蛋白质产品。

天然人促红细胞生成素包含4条糖链(3个N-联的和1个O-联的)。为 了使体内效能最大化，蛋白质需要三天线的和四天线的唾液酸化的N- 聚糖。然而，体外受体结合和基于细胞的分析测定显示：具有多支化 唾液酸化聚糖的促红细胞生成素和具有附加的N-糖基化位点的促红 细胞生成素相对于酶促去糖基化的促红细胞生成素呈现减少的结合。 该矛盾可以通过认为从循环系统清除解释。四天线唾液酸化促红细胞 生成素和达贝泊汀(darbepoetin)呈现比双天线唾液酸化的促红细胞生 成素和非糖基化的促红细胞生成素更长的血清半寿期。(促红细胞生成 素的主要清除途径是经过肾滤过，通过结合至脱唾液酸糖蛋白受体， 内皮细胞摄取和通过促红细胞生成素受体被靶细胞内在化。)

目前推向市场的重组促红细胞生成素形式包括具有三个四天线 N-聚糖结构的Epogen、和Aranesp、经工程改造的包含总共五个四天线 N-聚糖结构的两个附加N-糖基化位点的促红细胞生成素。添加这些额 外的N-聚糖连接位点已经导致更长的血清半寿期，并因此提高激素的 体内活性。这些促红细胞生成素由CHO细胞生产并与N-聚糖结构的不 均一混合物分泌。工艺过程开发用于富集四天线的唾液酸化的糖形(见 图1)。

过去努力改善促红细胞生成素的性质已经包括努力改变糖基化 例如通过增加糖基化位点，以及努力使蛋白质与聚合物例如聚乙二醇 缀合。参见，例如EP 0640619；WO 00/32772、WO 01/02017和WO 03/029291。尽管有这些尝试，仍然需要具有改善的性质的重组促红细 胞生成素，例如更易于给药；给药方案严格性更低；改善的药代动力 学和生物利用度和更低成本制备重组促红细胞生成素。详细地讲，用 于从低等真核细胞产生具有这些性质的促红细胞生成素组合物的增 强方法和材料仍是难以捉摸和所需目标。

发明概述

因此，本发明提供用于制备能够表达具有特异定向N-糖基化作用 的重组人促红细胞生成素的载体和宿主细胞、以及经化学修饰例如通 过PEG基化化学修饰的重组工程改造的糖蛋白组合物的方法和材料。

本发明提供低等真核生物，尤其是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) 的工程菌株，该工程菌株能够产生具有双天线N-聚糖结构的完全唾液 酸化的重组体EPO。

本发明也提供具有双天线聚糖的PEG基化的EPO。这些重组糖蛋 白组合物呈现先前在体外所见的增强的体内生物活性，同时维持增加 的血清半寿期。

因此，本发明提供用于制备PEG基化的促红细胞生成素蛋白组合 物的方法和材料，所述组合物包含多种N-联糖形，所述N-联糖形包含 连接至其中的至少一种N-联聚糖。在优选的实施方案中，该组合物包 含多种N-联聚糖，其中大于25摩尔百分率的所述多种N-联聚糖基本上 由选自以下的所需N-联聚糖结构组成：

GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂；GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂；GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂；