[发明专利]用于核酸扩增的化学修饰的寡核苷酸引物

说明书

相关领域的交叉申请

本申请要求2006年6月1日申请的美国临时专利申请第60/810,665号 的优先权，其标题为“Chemically Modified Oligonucleotide Primers For Nucleic Acid 扩增(用于核酸扩增的化学修饰的寡核苷酸引物)”，其在此作为参考并入。

技术领域

本发明涉及用于扩增核酸的方法和组合物。具体方面，本发明提供用于 热启动核酸扩增的方法和组合物。

技术背景

提供以下描述以有助于读者的理解。在本发明中，没有任何提供的信息 或引用的文献被承认是现有技术。

在现代分子生物学和生物技术中，PCR(聚合酶链反应)可能是被最广 泛使用的方法，并且被迅速应用于遗传检测、诊断学、法医学和生物防御。Kolmodin， L.A.等人的Nucleic Acid Protocols第569-580页(2000年)；Budowle，B.等人的301 Science第1852-53页(2003年)；Y.Sato等人的5(Suppl.1)Legal Medicine第 S191-S193页(2003页)；Saldanha，J.等人的43 J.Medical Virol.第72-76页(1994年)； Dahiya，R.等人的44 Biochemistry and Molecular Biology International第407-15页 (1998年)；和Elnifro，E.M.等人的13 Clin.Microbiol.Rev.第559-70页(2000年)。 PCR在美国专利第4,683,195号和第4,683,202号中被描述。在每一个PCR扩增过 程的循环中有几个典型的步骤。双链DNA靶序列在高温(～95℃)下进行第一热 变性。该第一变性的发生在本文称为“初始变性步骤(initial denaturation step)”。其 后是在较低温度(～60℃)下合成的寡核苷酸引物与每条链的退火。然后这些正向 或反向定向的寡核苷酸引物的每一个被延伸，该延伸是在高温(～70℃)下，从它 们的3’末端，通过热稳定的、镁离子依赖性的DNA聚合酶进行的，所述DNA聚 合酶与5’-脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)混合并产生焦磷酸(PPi)，如图1顶部对 正向寡核苷酸引物的描绘。

PCR的实用性是由其迅速提供约10⁶倍的靶扩增的能力以及高特异性 所达到的，这部分依赖于寡核苷酸引物杂交的特异性。寡核苷酸引物的序列和长 度因此被设计为，在退火所使用的温度下，仅与希望的靶序列杂交。然而，PCR 扩增反应通常在若干分钟或若干小时的期间在环境室温下准备，该温度远低于确 保寡核苷酸引物杂交特异性所需的温度范围。在这样的不严格的样品制备条件下， 寡核苷酸引物可能非特异性地与其它具有基本上非互补性的序列结合，并有可能 开始合成不希望的延伸产物，该延伸产物可与靶序列一起被放大。如已经被Chou， Q.等人讨论的，通过此“误引导(mis-priming)”的非特异性序列的扩增可以与所需 靶序列的扩增竞争，并能因此显著减少所需序列的扩增效率，特别是对于低拷贝 数量的靶。Chou，Q.等人的20 Nucleic Acids Res.第1717-23页(1992年)。

“引物二聚体”的形成是另一个非特异性杂交的问题形式，根据Chou， Q.等人，该引物二聚体形成是序列彼此交叉而又没有明显间插序列的两个寡核苷 酸引物扩增延伸的结果。这些调查进一步注意到，引物二聚体在PCR期间可以经 过扩增的寡聚化以产生寡核苷酸引物人为产物的复杂混合物，其质量通常与低拷 贝数量的扩增中特定PCR产品的产率成反比。