[发明专利]位点特异性聚乙二醇化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质、肽和其他分子中具有未氧化的巯基侧链和游离α-氨基的半胱氨酸残基的化学选择性聚乙二醇化的方法。 

背景技术

不像通常通过口服途径施用的小分子药物，基于蛋白质和肽的治疗剂由于它们极其低的口服生物利用度通常通过注射施用。注射后大多数蛋白质和肽会被酶快速断裂并从机体清除，导致短暂的体内循环半衰期。这种短暂的循环半衰期是效能较低、施用更频繁、患者顺应性减少以及蛋白质和肽治疗法成本较高的主要原因。因此，强烈需要开发延长蛋白质和肽药物作用的持续时间的方法。 

蛋白质或肽与聚乙二醇(PEG)的共价连接(Covalent attachment)已证明是增加机体中蛋白质和肽的循环半衰期的有用方法(Abuchowski，A.等人，Cancer Biochem.Biophys.，1984，7：175-186；Hershfield，M.S.等人，N.Engl.J.Medicine 316：589-596；和Meyers，F.J.等人，Clin.Pharmacol.Ther.，1991，49：307-313)。PEG与蛋白质和肽的共价连接不仅保护分子免遭酶降解，而且降低它们从机体中清除的速率。与蛋白质连接的PEG的大小对蛋白质的循环半衰期有显著的影响。通常PEG越大，结合的蛋白质的体内半衰期越长。几种大小的PEG市售可得(Nektar Advanced PEGylationCatalog 2005-2006；和NOF DDS Catalogue Ver 7.1)，它们适用于产生具有靶向循环半衰期的蛋白质和肽。PEG部分还增加蛋白质、肽和其他分子的水溶性并且降低免疫原性(Katre，N.V.等人，Proc.Natl.Aced.Sci.USA，1998，84：1487-1491；和Katre N.V.等人，J.Immunology，1990， 144：209-213)。 

已经在文献中报道对蛋白质进行聚乙二醇化的几种方法。例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-PEG用于聚乙二醇化蛋白质的N-末端和赖氨酸残基的游离氨基。由于蛋白质通常包含多个赖氨酸残基和末端氨基，所以通过使用这种方法蛋白质的多个位点将被聚乙二醇化。这种非选择性聚乙二醇化导致聚乙二醇化蛋白质的功效降低，因为多个PEG部分通常会扰乱蛋白质与其生物靶分子之间的相互作用(Teh，L.-C.和Chapman，G.E.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1988，150：391-398；及Clark，R.等人，J.Biol.Chem.1996，271：21969-21977)。多位点的非选择性聚乙二醇化还造成终产物的非均质混合物。很多这些非均质的聚乙二醇化的蛋白质由于低的比活性而不适于医疗用途。很难纯化和表征非均质的聚乙二醇化的蛋白质。不同批的非均质的聚乙二醇化的蛋白质产物之间含量的变化通常很高，并且很难对这些混合物进行质量控制。 

尽管含有醛基的PEG已用于在还原剂的存在下对蛋白质的氨基末端进行聚乙二醇化，但是这样的方法不产生唯一的N-末端聚乙二醇化的蛋白质，蛋白质的赖氨酸残基也被聚乙二醇化。因此，所得的蛋白质也是非均质混合物(Kinstler O.B.等人，U.S.Application No.09/817,725)。这种方法也具有使用苛刻的还原反应条件的缺点。还原剂如氰基硼氢化物能损害蛋白质，造成较低的反应产率。 

具有马来酰亚胺官能团的PEG用于选择性聚乙二醇化蛋白质中的半胱氨酸残基的游离巯基。这种方法经常需要带来新半胱氨酸的点突变。由于大多数蛋白质包含一个或多个半胱氨酸残基，所以为选择性阻止该新的“非天然”半胱氨酸残基的巯基与其他半胱氨酸残基形成二硫键、并且然后为了选择性聚乙二醇化该特定的新半胱氨酸，需要复杂的反应条件(2004年6月22日授权的美国专利第6,753,165号；和2003年8月19日授权的美国专利第6,608,183号)。甚至在受控的反应条件下，其他半胱氨酸残基也可被聚乙二醇化并且获得非均质材料。 

曾报道生长激素类似物的乙酰苯丙氨酸残基的位点特异性聚乙二醇 化。这种方法需要带来非天然氨基酸乙酰苯丙氨酸的点突变(于2005年1月28号提交的美国专利申请第11/046,432号)。这种方法的缺点之一是含非天然氨基酸如乙酰苯丙氨酸的蛋白质的聚乙二醇化只可在细菌中进行但不可在哺乳动物细胞中进行。