[发明专利]使用可逆修饰寡核苷酸扩增核酸

权利要求书

1.一种扩增靶核酸序列或信号的方法，该方法中所用的扩增反应混合物中含有至少一种具有非羟基3’端的可逆修饰寡核苷酸；该非羟基3’端可以在一种化学物质和一定温度范围作用下转化为羟基3’端，其中所述温度范围为高于60℃，其中所述可逆修饰寡核苷酸在其3’端具有一个羧酸酯基，并且其中所述羧酸酯是马来酸酯，并且使用羟胺或肼来再生3’羟基。

2.权利要求1所述的方法，包括以下步骤：

(a)将一个怀疑含有靶核苷酸的样本与扩增反应混合物相接触，该反应混合物含有至少一种具有非羟基3’端的可逆修饰寡核苷酸，该非羟基3’端可在一种化学物质和一定温度范围作用下转化为羟基3’端，其中所述温度范围为高于60℃；

(b)将步骤(a)中混合物与所述的化学物质相接触和置于一定温度范围下，充分作用一段时间以再生羟基3’端；和

(c)进行扩增反应。

3.权利要求1所述的方法，其中所述核酸为核糖核酸，所述方法包括如下步骤：

(a)将一个怀疑含有靶核糖核酸的样本与扩增反应混合物相接触，该反应混合物含有至少一种具有非羟基3’端的一种第一可逆修饰寡核苷酸，该非羟基3’端可在一种第一化学物质和一个第一温度范围下转化为羟基3’端，其中所述第一温度范围为高于60℃；

(b)在核糖核酸的逆转录条件下，孵育步骤(a)中混合物；

(c)将步骤(b)中混合物与所述第一化学物质相接触和置于所述第一温度范围下，充分作用以使得所述第一可逆修饰的寡核苷酸的3’端再生为羟基；

(d)进行扩增反应，产生引物延伸产物。

4.权利要求3所述的方法，其中所述扩增反应混合物含有至少一种第二可逆修饰寡核苷酸，其中所述第二可逆性修饰寡核苷酸具有非羟基团3’端，且该非羟基3’端可以在一种第二化学物质和一个第二温度范围作用下被转化成羟基3’端，其中所述第二温度范围为高于60℃；该方法还包括下述步骤，在步骤(b)之前，将步骤(a)的混合物与所述第二化学物质相接触和置于所述第二温度范围下，充分作用以使得所述第二可逆修饰寡核苷酸的3’端再生为羟基。

5.权利要求3所述方法，所述方法为一种两酶体系的一步法RT-PCR过程，其中至少使用了一种逆转录酶和一种耐热DNA聚合酶，或者所述方法为一种单酶体系的一步法RT-PCR的过程，其中只使用了一种兼有逆转录酶和DNA聚合酶双重功能的酶。

6.权利要求2-5任一项所述的方法，其中所述非羟基3’端有至少25％被转化成羟基3’端。

7.权利要求6所述的方法，其中所述非羟基3’端有至少50％被转化成羟基3’端。

8.权利要求6所述的方法，其中所述非羟基3’端有至少75％被转化成羟基3’端。

9.权利要求6所述的方法，其中所述非羟基3’端有至少90％被转化成羟基3’端。

10.权利要求1所述的方法，在再生3’羟基时，一种化学物质和在一定温度范围内孵育同时作用，其中所述温度范围为高于60℃。

11.权利要求1所述的方法，其中所述羧酸酯是马来酸酯，并且使用羟胺或肼来再生3’羟基，并同时在一定温度范围内孵育，其中所述温度范围为高于60℃。

12.权利要求1-5任一项所述的方法，应用于侵入检测、聚合酶链式反应、连接酶链式反应、滚环扩增、链置换扩增、转录介导扩增、基于核酸序列的扩增、自主序列复制系统、单引物等温扩增、指数单引物等温扩增或环介导扩增的过程中。