[发明专利]使用可逆修饰寡核苷酸扩增核酸

说明书

本专利申请要求以2007年7月31日提交的美国专利No.60/834,41作为优先权基础。

技术领域

本发明主要涉及核酸化学领域，更具体而言，本发明涉及扩增核酸序列或信号的方法和减少非特异性扩增的方法。

背景技术

核酸扩增技术已被广泛应用于临床微生物学、血液检测、食品安全、遗传病的诊断与预后、环境微生物学、药物靶点发现和鉴定、法医学以及其他生物医学方面的研究。其中核酸扩增的简易高效性、特异性、灵敏度、准确度、精确度，以及经济可承受性至关重要。

核酸序列特异性扩增可以对特定序列进行灵敏的检测。聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应(LCR)是两种热循环扩增技术。

相比PCR和LCR，等温扩增技术是一种在基本不变的温度下进行的扩增方法。转录介导扩增(Transcription-mediated amplification，TMA)、基于核酸序列扩增(Nucleicacid sequence-based amplification，NASBA)、链置换扩增(strand-displacementamplifeation，SDA)、滚环扩增(rollingcircle amplification，RCA)、单引物等温扩增(single primer isothermalamplificatio，SPIA^TM)、指数单引物等温扩增(exponentialsingle primerisothermal amplification，X-SPIA^TM)、自主序列复制系统(self-sustainedsequence replication，3SR)和环介导等温核酸扩增(loopmediatedisothermal amplification，LAMP)均为等温扩增的具体实例。核酸序列也可通过信号扩增过程来检测，比如循环探针技术(cycling probe)和侵入检测(Invader Assay)。当杂交探针被核酸酶切除时，将会产生可检测的信号。

由于所有的酶，无论其耐热性如何，都在一定的温度范围内具有活性，这样的性质会在其特异性、灵敏性、信噪比等方面对核酸扩增产生负面影响。这已在PCR过程中被明确地证实。耐热DNA聚合酶对PCR而言是必不可少的。虽然耐热DNA聚合酶活性最高的温度在60-75℃，但在低温下它依然具有活性。即使在室温下它也仍然具有明显的活性。但是其低温时的活性将会导致引物二聚体的形成和非特异性的扩增，从而降低检测灵敏度。

使用热启动(hot-start)技术可以提高DNA PCR的效果。热启动技术是指任何具有下述特征的组装PCR反应的方法，即通过物理或化学方法使得在低温下反应组分中的一种或多种成分与其他成分分离开来，而在高温下使得反应发生。热启动PCR技术分为以下几种：

1.通过物理屏障分隔将必需组分分隔为至少两部分，如美国专利5,411,876、5,565,339、5,413,924和5,643,764所述(上述文献均通过援引的方式纳入本文)。该屏障可通过高温加热来消除。

2.使用可逆酶抑制剂来抑制酶在低温下的活性，如美国专利5,338,671、5,677,152、5,773,258、6,183,998、5,693,502、5,874,557、5,763,173、6,020,130和6,183,967中所述(上述文献均通过援引的方式纳入本文)。与抑制剂的结合方式是非共价的或共价的。这些方法的热启动技术是在均一相中进行，这类技术也是目前最为广泛使用的。

3.辅助因子的相分离法，如美国专利6,403,341所述(该文献通过援引的方式纳入本文)。Mg²⁺在低温下会沉淀，并会随着温度的上升而溶解。

一步法RT PCR(One-step RT PCR)是在一个反应容器中连续完成RNA分子的逆转录过程与互补性cDNA分子的扩增过程，从而实现扩增靶点RNA的方法。靶点RNA分子包括艾滋病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、西尼罗河脑膜炎病毒(WNV)、人类流感病毒、禽流感病毒、登革病毒、埃博拉病毒等。在美国，检测捐血者血液中是否存在HIV，HBV，HCV和WNV是强制性的。一步法RT PCR在这些临床检验以及血液检测时有重要的作用。遗憾的是，目前没有一种热启动技术可以有效地应用于一步法RT PCR，原因如下：

1.大部分的逆转录酶(逆转录过程的关键酶)不能作为热启动过程的靶点，原因在于它们不具有耐热性，会在高温孵育后丧失活性。