[发明专利]分离HIV-1蛋白酶抑制剂的体系和药物组合物

说明书

本发明要求了申请日为2006年6月9日、申请号为60/812,685的美国临 时专利申请的优先权，该美国临时专利申请的全部内容在此引入本文作为参 考。

关于本发明为联邦资助的科研项目的声明：本项发明获得了国立卫生研究 院(NIH)的资助，项目批准号为NIH NIGM R01 GM63080和N1H-N1AID R01 AI40891。美国政府对本发明具有一定的权力。

技术领域

本发明至少涉及细胞生物学、分子生物学和医学领域，特别涉及治疗 HIV/AIDS的药物组合物。

背景技术

HIV/AIDS依然是不可治愈的疾病，威胁全球数百万人的生命。鸡尾酒疗 法，一般也称HAART或ART，是目前可以使患者的HIV-1降低到能够检测 出的水平之下的最为成功的抗逆转录病毒疗法。典型的ART疗法需要联合使 用一个HIV-1蛋白酶抑制剂(HIV-1PI)和两个HIV-1逆转录酶抑制剂。在 两类抗-HIV治疗药物中，HIV-1 PI是最有效的病毒抑制剂，其单独使用也能 使病毒减少2-3个数量级。HIV蛋白酶是产生病毒感染力的根本，它能将病毒 多聚前体蛋白切割成活性病毒酶(逆转录酶、蛋白酶和整合酶)和结构蛋白。 因此，HIV-1蛋白酶被用来生产病毒的结构蛋白和酶，并且对于感染性病毒粒 子的成熟也是必须的。目前，获得美国FDA批准的PI一共有8个，所有的这 些PI都属于与蛋白酶的活性位点结合的竞争性抑制剂，事实上，这其中的许 多PI都是设计成能够与蛋白酶的活性位点结构的匹配。PI与蛋白酶的活性位 点的结合阻止蛋白酶切割病毒前体聚合多肽，因而阻断了随后的病毒成熟。 ART疗法面临的主要问题之一是病毒会快速对药物产生抗性，病毒的PI抗性 一般是由于蛋白酶基因内逐步累积的突变而出现，并且这种抗性增长迅速。 ART治疗失败经常是多抗药性导致，即蛋白酶变得对使用的多数或全部PI有 抗性，这警示我们HIV多抗药性最终有可能超过目前我们所能获得的PI数量。 因而，目前急切需要开发其他能够对有抗药性的蛋白酶具有药效的PI。

发明内容

本发明主要涉及一种与HIV治疗药物的筛选和使用有关的体系、方法和 药物组合物。

特别是，发明人在本领域取得了一定的进步，使得筛选HIV-1蛋白酶抑 制剂的标准方法得以发展和利用，当然这个方法也可以替换成HIV-2蛋白酶 抑制剂的筛选方法。在本申请文件给出的第一个实施方案中，裂殖酵母因其内 的蛋白酶基因高水平表达而致死，这一发现为鉴别蛋白酶抑制剂提供了基础， 当蛋白酶基因表达时，可以通过蛋白酶抑制剂具有的使细胞存活生长的能力而 将其分离出来。

在本发明的一些具体的实施方案中，提供了基于细胞的标准筛选方法，该 方法可以鉴别出能同时抑制野生型和具有抗性的蛋白酶的化合物。这些新的抑 制剂在某些情况下可能不会与活性位点结合，因此为我们揭示了抑制蛋白酶活 性的新途径，即通过靶向蛋白酶的其他区域和功能区。具体地，本发明可以在 用于筛选HIV-1蛋白酶的广谱抑制剂的全自动高通量分子筛选(HTS)方法中 采用一些基于裂殖酵母细胞的测试。更具体地，这些测试可以使用96孔板模 式和比较小型化的模式。更具体地，蛋白酶活性的检测可以采用吸光率检测细 胞密度，或者也可以采用荧光检测细胞活性，如可以将荧光检测作为进一步的 确证实验。在其他的或替代的实施方案中，采用对GFP-底物-Vpr融合蛋白进 行绿色荧光重定位来作为检测蛋白酶活性的反向筛选试验。更具体地，这三种 检测方法可以被应用到HTS模式中和/或利用一些潜在的抑制剂文库，例如 Sigma的LOPAC1280化合物文库。

本发明的某些内容中，还提供了在几个水平上来筛选鉴定蛋白酶抑制剂的 方法。例如，当蛋白酶基因表达时，将细胞活性作为筛选指标来筛选鉴别一些 能够使细胞继续存活生长的蛋白酶抑制剂。基于另一水平的筛选方法，使用体 外酶法测定蛋白酶活性的方法来筛选蛋白酶抑制剂，这一方法可以与细胞活性 测定方法联合使用，也可以替代细胞活性测定方法，例如酶解蛋白酶底物。虽 然在一般的实施方案中酶切位点可以是任何HIV-1能够酶切的合适位点，但 在特定的实施方案中，酶切位点序列可以优选SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4 所示序列。