[发明专利]编码N‑甲基腐胺氧化酶之核酸及其应用

说明书

临时专利申请之优先权

本发明要求于2006年6月19日所申请美国临时专利申请，申请号为60/814,542及于2007年2月16日所申请美国临时专利申请，申请号为60/901,654之优先权。

技术领域

本发明涉及植物，植物细胞或其它类细胞之分子生物学及生物碱合成。除与其它事项相关外，该发明还涉及编码N-甲基腐胺氧化酶(N-methylputrescine oxidase，MPO)的核酸序列以及应用该核酸序列改良植物中生产生物碱的方法，尤其是但不完全是应用该核酸序列在烟草植物中生产烟碱，及在植物细胞或其它类细胞中生产生物碱合成酶的方法。

背景技术

吡咯烷类生物碱(例如烟碱)及托烷类生物碱(例如东茛菪碱和古柯碱)是具有多种不同药理活性的植物天然产物。例如，烟碱可以促进认知机能，并应用于戒烟治疗中的烟碱替代疗法。托烷类生物碱是重要的抗胆碱能类药物。古柯碱被用作局部麻醉药。这些化合物均从植物分离，并被作为药物使用。

人们有兴趣通过遗传工程方式来增加植物和植物细胞中吡咯烷类生物碱及托烷类生物碱的生产，以便更有效地商业化生产这些化合物以用于药物制造业。增加上述两种生物碱的生产可以通过选择育种，或通过使用编码这些生物碱合成酶基因的遗传工程。累积代谢途径中间产物或减少生物碱终末产物的遗传工程方法包括经典或定向诱变，如定向诱导基因组局部突变技术(Targeting Induced Local Lesions in Genomes，TILLING)，或利用RNA干扰及相关技术特异性沉默编码这些酶的基因。

人们也有兴趣阻断上述生物碱合成途径中某些特定的代谢步骤，以累积本身可能具有高价值的代谢途径中间产物，或生产包括修饰过或含量减少的生物碱终末产物的植物。烟碱含量经遗传工程而减少的烟草植物可能有助于生产来自于植物的药物，烟碱含量低或无烟碱的香烟。所述香烟可以用于辅助戒烟(Benowitz et al.Clin Pharmocol Ther.80(6)：703-14(2006))，和用于生产低毒性工业产品，食品或生物量农作物。

人们对编码吡咯烷类生物碱及托烷类生物碱的生物合成酶的基因知之甚少，这限制了通过遗传工程生成这些有效化合物代谢途径的能力。

一个编码参与吡咯烷类生物碱合成酶的已知基因的例子是喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)基因，所述的QPT基因从烟草和黄花烟草中克隆的。见美国专利6,423,520及专利6,586,661及Sinclair et al.，Plant Mol.Biol.44：603-17(2000)。抑制QPT基因表达能显著降低转基因烟草植物中烟碱含量。Xie et al.，Recent Advances in Tobacco Science 30：17-37(2004)。

美国专利5,369,023及5,260,205讨论通过抑制腐胺甲基转换酶(PMT)核酸序列来降低烟碱含量。抑制内源性PMT核酸序列降低烟碱含量，并增加去氢新烟碱含量2至6倍。Hibi et al.，Plant Cell 6：723-35(1994)；Sato et al.Proc Natl Acad Sci USA 98：367-72(2001)；Chintapakorn and Hamill，Plant Mol.Biol.53：87-105(2003)；Steppuhn et al.，PLoS Biol.2：8：e217：1074-1080(2004)。烟草PMT基因在美花烟草超表达可增加烟碱含量。(Satoet al.Proc Natl Acad Sci USA 98：367-72(2001))。

抑制内源性基因序列A622及NBB1可降低烟草植物中烟碱含量。见国际专利公开号WO 2006/109197。已从烟草中克隆转换烟碱为去甲烟碱的细胞色素P450单氧化酶基因。Siminszky B.，et al.，Proc Natl Acad Sci USA102：14919-24，(2005)；Gavilano et al.J.Agric.Food Chem.54，9071-9078(2006)。

MPO酶活性是三十年前在烟草植物根部最初检测到，Mizusaki S et al.，Phytochemistry 11：2757-2762(1972)，但MPO基因在本发明前并未得到确定。