[发明专利]专一性寡核苷酸和其在核酸扩增与检测中的用途

权利要求书

1.一种非诊断目的的不对称聚合酶链反应(PCR)扩增和检测方法，其包含

(a)通过包括引物退火温度的重复热循环对反应混合物实施热循环，所述反应 混合物含有第一脱氧核糖核酸(DNA)扩增靶序列、第一过量引物和第一限制引物、 dNTP、未显示非靶依赖性探针解离的热稳定DNA聚合酶和低温第一杂交探针，所述 第一杂交探针的浓度调节熔融温度比所述第一限制引物的浓度调节熔融温度低至少5 ℃并且为线性DNA寡核苷酸，其对非引物依赖性5’外切核酸酶解离的敏感性已通过 对所述寡核苷酸的结构修饰而改变；

其中所述结构修饰选自由以下组成的群组：由2-7个不与第一扩增子链杂交的核 苷酸构成的5’末端臂、具有通过除3个或更多个连续亚甲基的链以外的方式与其连接 的标记部分的5’末端核苷酸和位于所述探针5’末端且由于在70℃以上温度下自退火 而形成发夹结构的非互补核苷酸，所述发夹结构具有长为2-5个核苷酸的茎部；

(b)使所述探针与所述第一扩增子链杂交，所述第一扩增子链是在所述限制引 物耗尽后所述过量引物于第一温度下的延伸产物；和

(c)检测所述探针的解离。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物含有第二DNA扩增靶序列、 用于所述第二DNA扩增靶序列的第二过量引物和第二限制引物和用于通过所述第二 过量引物的延伸形成的第二扩增子链的第二杂交探针，其中检测包括在第二温度下检 测所述第二探针是否已杂交。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述第一和第二探针是经相同荧光团标记的 双重标记荧光探针。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述第二探针是低温探针，其浓度调节熔融 温度比所述第一限制引物的浓度调节熔融温度低至少5℃，并且与所述第一温度相差 至少5℃。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述第二温度比所述第一温度低至少10℃。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述第二探针通过使所述反应温度围绕其熔 融温度快速振荡而解离。

7.如权利要求3所述的方法，其中所述第二温度比所述第一温度高至少10℃。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述探针的结构修饰能够防止等温非引物依 赖性5’核酸酶解离。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述探针对通过在所述探针Tm附近温度下 热振荡引发的解离无抗性，并且检测包括围绕所述探针-扩增子杂合体之熔融温度对 其进行快速热振荡以产生探针解离。