[发明专利]专一性寡核苷酸和其在核酸扩增与检测中的用途

说明书

相关申请交叉参考案

本申请案主张2006年7月17日申请的美国临时专利申请案第60/831,223号的优 先权和权益，其全文以引用方式并入本文中。

技术领域

本申请案涉及核酸扩增反应和扩增产物的检测，具体来说其包括采用聚合酶链反 应(一般称为PCR)的扩增。

背景技术

核酸扩增技术和分析为人所熟知。某些扩增DNA的反应是等温的，例如基于核 酸序列的扩增(NASBA)。其它技术采用热循环，例如聚合酶链反应(PCR)。采用使用 PCR的扩增的扩增和分析阐述于(例如)美国专利第4,683,202号、第4,683,195号和 第4,965,188号中，并且概述于PCR方案，方法和应用的引导(PCR PROTOCOLS，a guide to Methods and Applications)，英尼斯(INNIS)等人编辑，学术出版社(Academic Press)(圣地亚哥，CA(USA)1990)中，所述各文献都是全文以引用方式并入本文中。 PCR扩增一般设计为对称性，也就是说通过使用等摩尔或大致等摩尔浓度的匹配引物 对(也就是说具有相等熔融温度(Tm′s)的正向引物和反向引物)来制备双链产物(或 “扩增子”)。已发现在用PCR扩增反应直接大量制备单链扩增子中具有有限应用 的技术是阐述于以下文献中的“不对称PCR”：吉伦斯顿(Gyllensten)和厄里克(Erlich)， “通过聚合酶链反应生成单链DNA和其在HLA-DQA基因座直接测序中的应用 (Generation of Single-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reaction and Its Application to Direct Sequencing of the HLA-DQA Locus)”，国家科学院学报(Proc.Natl. Acad.Sci.)(USA)85：7652-7656(1988)；和美国专利第5.066,584号。不对称PCR是 不对称PCR扩增方法，其与对称PCR的不同之处在于将引物中的一种稀释至五分之 一至百分之一浓度，以使其以其它三种引物浓度1-20％的有限量存在。因此，扩增由 指数期和随后的线性扩增组成，在指数期中两种引物延伸生成双链扩增子，并且在线 性扩增中仅保留一种引物，其生成单链扩增子。

较新的不对称PCR扩增方法是“指数后线性扩增PCR”(LATE-PCR)，其以不同 浓度使用各引物但其中所述引物并不像对称PCR和不对称PCR中那样是“匹配的”。 桑切斯(Sanchez)等人(2004)，国家科学院学报(USA)101：1933-1938，公开的国际专 利申请案WO 03/054233(2003年7月3日)，和皮尔斯(Pierce)等人(2005)，国家科 学院学报(USA)102，8609-8614，上述所有文献都是全文以引用方式并入本文中。DNA 扩增方法可通过以下方式用于RNA靶：首先实施逆转录以产生cDNA，然后通过(例 如)上述PCR方法中的一种对其实施扩增。

可以各种方式实施核酸扩增产物的检测和分析。可使用在嵌入双链DNA后或在 与双链DNA交互作用后发荧光的染料来监测双链扩增子，例如SYBR绿或SYBR金。 例如，可参见美国专利第5,994,056号。可对扩增子实施测序反应，例如习用双脱氧 测序或焦磷酸测序、实时测序-合成方法。杂交探针通常用于检测中。探针可经标记 或未经标记。杂交探针的检测可通过以下方式来进行：物理特征，例如尺寸；在诸如 成色反应等后续事件中的参与；或检测施用至探针的标记，例如放射活性或荧光标记。 经标记探针的实例是在引物延伸期间解离的5’核酸酶探针(美国专利第5,210,015号、 第5,487,972号和第5,538,848号)、分子信标探针(美国专利第5,925,517号、第 6,103,476号和第6,365,729号)、尹-杨(Yin-Yang)双链探针(李(Li)，Q.等人(2002)，核 酸研究(Nucl.Acid Res.)，30：e5)和FRET探针对。