[发明专利]重组蛋白的重折叠

权利要求书

1.一种用于从原核细胞培养物中回收重折叠的重组蛋白的方法，其中所述 重组蛋白是VEGF₁₆₅，该方法包括下列步骤：

(a)从所述原核细胞培养物中分离重组蛋白；

(b)使所述蛋白质在第一缓冲溶液中溶解，所述第一缓冲溶液其pH大于 9且包含(i)终浓度1M尿素、300mM精氨酸、10mM CHES、5mM EDTA，pH 11；或(i)终浓度1M尿素、300mM精氨酸、10mM TRIS、 5mM EDTA，pH 11；

(c)使所述溶解的蛋白质在第二缓冲溶液中重折叠，所述第二缓冲溶液 其pH大于9但小于等于11且包含(i)终浓度1M尿素、15mM半胱氨 酸、2mM DTT、100mM精氨酸、10mM CHES、5mM EDTA，pH 10； 或(ii)终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、0.5-2mM DTT、100mM 精氨酸、10mM TRIS、5mM EDTA，pH 10且在室温以 ak_La＝0.001-0.1min^-1通入空气或氧气达6-24小时；并

(d)回收所述重折叠的重组蛋白。

2.权利要求1的方法，其中将所述重组蛋白在所述第一缓冲溶液中温育至 少1小时。

3.权利要求2的方法，其中所述温育是在2-40℃进行的。

4.权利要求1的方法，还包括通过通入氮气来使所述重折叠的重组蛋白稳 定。

5.权利要求1的方法，其中所述回收步骤(d)包括：使含有所述重组蛋白的 所述第二缓冲溶液澄清，并使所述重折叠的重组蛋白相继接触混合式层 析支持物、阳离子层析支持物、和第一疏水相互作用层析支持物，并从 每个支持物中选择性洗脱所述重折叠的重组蛋白。

6.权利要求5的方法，其中所述澄清步骤包括：添加去污剂至1％的终浓度， 调节pH至8.5-9.5，在25-30℃将溶液温育1-10小时，将所述溶液离心；并 将从所述离心步骤中回收的液体过滤。

7.权利要求5的方法，还包括：使所述重折叠的重组蛋白接触第二疏水相 互作用层析支持物或离子交换支持物，并从所述支持物中选择性洗脱所 述重折叠的重组蛋白。

8.权利要求5的方法，其中所述第一疏水相互作用层析支持物选自丁基-、 丙基、辛基-、苯基-和芳基-琼脂糖树脂。

9.权利要求7的方法，其中所述第二疏水相互作用层析支持物选自丁基-、 丙基、辛基-、苯基-和芳基-琼脂糖树脂。

10.一种用于从原核细胞培养物中回收重折叠的重组蛋白的方法，其中所述 重组蛋白是VEGF₁₆₅，该方法包括下列步骤：

(a)从所述原核细胞培养物中分离重组蛋白；

(b)使所述蛋白质在缓冲溶液中溶解并重折叠，所述缓冲溶液其pH大于 9但小于等于11且包含(i)终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、2mM DTT、100mM精氨酸、10mM CHES、5mM EDTA，pH10；或(ii)终 浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、0.5-2mM DTT、100mM精氨酸、 10mM TRIS、5mM EDTA，pH 10且在室温以ak_La＝0.001-0.1min^-1通 入空气或氧气达6-24小时；并

(c)回收所述重折叠的重组蛋白。

11.权利要求10的方法，其中所述回收步骤包括：使含有所述重组蛋白的所 述缓冲溶液澄清，并使所述重折叠的重组蛋白相继接触混合模式层析支 持物、阳离子层析支持物、和第一疏水层析支持物，并从每个支持物中 选择性洗脱所述重折叠的重组蛋白。

12.权利要求11的方法，其中所述澄清步骤包括：添加去污剂至1％的终浓度， 调节pH至8.5-9.5，在25-30℃将溶液温育1-10小时，将所述溶液离心，并 将从所述离心步骤中回收的液体过滤。