[发明专利]重组蛋白的重折叠

说明书

相关申请

本申请要求2006年7月14日提交的美国临时申请流水号60/830,831的优 先权及权益，在此完整收录其说明书。

发明领域

本发明涉及用于获得在细胞培养物中生成的异源重组蛋白的方法。本发 明包括用于回收和纯化重折叠的重组蛋白的方法，所述重组蛋白已经在原核 宿主细胞中生成并存在于这些细胞中，典型地存在于周质空间或胞内空间 中。所述在原核宿主细胞中生成的重组蛋白还可以作为可溶性蛋白质或者作 为可溶性蛋白质和不溶性蛋白质的混合物被发现。

发明背景

许多治疗上有关的重组蛋白是在多种宿主生物体中生产的。大多数蛋白 质可以在真核宿主(诸如CHO细胞)中以它们的天然形式表达。动物细胞培 养一般要求延长生长时间以达到最大的细胞密度并最终获得比原核细胞培 养低的细胞密度(Cleland，J.(1993)ACS Symposium Series 526，ProteinFolding：In Vivo and In Vitro，American Chemical Society)。另外，动物细胞培 养常常要求昂贵的培养基，其含有可能干扰所需蛋白质回收的培养组分 (growth components)。细菌宿主表达系统为生产规模的重组蛋白生产提供了 有成本效益的替代方案。有许多关于重组蛋白的常规细菌表达的美国专利， 包括美国专利第4,565,785号；第4,673,641号；第4,795,706号；及第4,710,473 号。该生产方法的一个主要优点是通过离心或微滤容易地从细胞组分中分离 产物的能力。参见例如Kipriyanov和Little，(1999)Molecular Biotechnology，12： 173-201；及Skerra和Pluckthun，(1988)Science，240：1038-1040。

然而，细菌表达系统(诸如大肠杆菌)缺乏促进蛋白质正确重折叠的细 胞机器，而且一般不导致大蛋白质分泌进入培养基。在细菌宿主细胞中表达 的重组蛋白常常被发现是包涵体，其由部分折叠的和错误折叠的还原的蛋白 质的密实块组成。参见例如Baneyx，(1999)Current Opin.Biotechnology10：411-421；及Villaverde和Carrio，(2003)Biotech.Letts.25：1385-1395。蛋白 质也可以在不形成包涵体的情况中表达。参见例如同前。典型地在包涵体中， 重组蛋白一般是无活性的。

另外，重折叠常常产生错误折叠的和二硫化物连接的二聚体、三聚体、 和多聚体(Morris等，(1990)Biochem.J.，268：803-806；Toren等，(1988)Anal.Biochem.，169：287-299)。这种缔合现象在蛋白质重折叠过程中是非常普通 的，特别是在较高的蛋白质浓度，而且常常表现为牵涉经由部分折叠的中间 体的疏水相互作用的缔合(Cleland和Wang，(1990)Biochemistry， 29：11072-11078)。