[发明专利]将来自脐带基质的干细胞分化为肝细胞谱系细胞

说明书

对相关申请的交叉参考

根据美国专利法35 U.S.C.§119(e)，本申请要求提交于2006年6月28日的 美国临时专利申请号60/817,251的利益，将所述申请通过参考完全结合于 本文。

发明背景

发明领域

本发明涉及自任何具有脐带的动物，包括人类，分离及使用干细胞以 分化为肝细胞系细胞。更具体而言，本发明涉及使脐带基质细胞分化为肝 细胞样细胞的方法。本发明还适用于提供易于获得的肝细胞样细胞供应， 以用于包括药物筛选、药物与药物相互作用、移植及疾病治疗的多种设定 (settings)。

相关领域的描述

通过器官移植来治疗肝病已显示出功效及进展。然而，关于移植疗法 的问题已集中于器官可用性及适合性。适合的器官供体已日益缺乏，且存 在对替代疗法的需要。基于细胞的疗法已在再生医学领域中显示有一定前 景，但缺乏移植功效。在充分开发用于肝病治疗的基于细胞的疗法的领域 中需要完成更多研究(Allen JW和Bhatia SN.Tissue Engineering(组织工程). 2002；8(5)：725-737；H.C.Fiegel CL等J Cell Mol Med.(细胞分子药物杂 志)2006；10(3)：577-587)。

细胞色素P450的诱导及抑制是药物和其它生物异源物质的氧化代谢 的关键机制。临床上关注用于研究人体内药物代谢的肝模型。肝细胞的原 代培养物确实在一段时间内表现药物代谢活性，但在长期培养中将失去该 能力。使用原代肝细胞培养物的其它障碍包括：伦理原因、源自供体的组 织的可用性、原代培养物的较短可用寿命(Donato M等Drug Metab Dispos. 1995；23(5)：553-558；Li AP等Chemico-Biological Interactions Proceedings of the First Symposium of the Hepatocyte Users Group of North America(北美 肝细胞使用者组的首届座谈会的化学生物相互作用进展).1997； 107(1-2)：5-16)。因此，用于研究药物相互作用及细胞毒性的适合模型在筛 选新药物或新治疗产品中将证明是有利的。

肝是众多内源性化合物及生物异源物质的代谢的主要部位，这是因为 肝细胞(其占肝脏细胞的80％)含有大量平滑内质网，其中存在众多代谢酶。 这些代谢酶主要涉及两种主要类型的过程：由P450单加氧酶催化的氧化还 原反应(第I阶段)和与内源性分子的结合(第II阶段)。在药物发现及开发中， 已主要致力于定义新化合物的代谢概况及药物代谢动力学。临床前开发的 主要部分包括对影响药物分解及消除的肝酶进行表征。

已有超过三十种药物与严重，通常致命的药物毒性相关，该药物毒性 仅在销售后才为人所了解。当前用于药物毒性早期测试的技术的一个局限 性在于缺乏测试系统的遗传多样性。因此，在此项技术中仍需要易于获得 且具备遗传多样性的肝细胞样细胞系的供应，以用于早期药物毒性测试。 本发明提供这种优势及其它优势。

发明概述

本发明的一个方面是提供一种使脐带基质细胞分化为肝细胞样细胞 的方法，其包含使脐带基质细胞与前诱导培养基接触；使脐带基质细胞与 分化培养基接触；和使脐带基质细胞与成熟培养基接触，接触的时间足以 使脐带基质细胞分化为肝细胞样细胞。

本发明的另一个方面是提供一种在体外评估化合物的毒性的方法，其 包括使根据本发明的自脐带基质细胞分化的肝细胞样细胞与所述化合物 接触；和测量该肝细胞样细胞的生存力，其中与不存在所述化合物的情况 下的生存力比较，存在所述化合物的情况下的生存力的减少指示所述化合 物在体内具有毒性。

本发明的另一个方面是提供一种在体外评估化合物活性的方法，其包 括使根据本发明的自脐带基质细胞分化的代谢活性肝细胞样细胞与所述 化合物接触；和测量该肝细胞样细胞的代谢活性，其中与不存在所述化合 物的情况下的代谢活性比较，在存在所述化合物的情况下的代谢活性的减 少或增加指示所述化合物在体内具有活性。