[发明专利]微量mRNA的扩增方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微量mRNA的扩增方法及其应用，更具体地说，用于cDNA文库(library)的制作、mRNA的正义(sense)链的扩增、编码mRNA的正义链的标识探针的制作以及阶段性减影(subtraction)等的微量mRNA的扩增方法及其应用。 

背景技术

一直以来，作为基因的分析方法，众所周知例如分析cDNA文库等的方法。cDNA文库是通过从生物细胞提炼出mRNA，并由该mRNA合成cDNA来制作的。此时，从细胞提炼的mRNA通常是极微量的。当从生体内存在的许多种细胞提炼mRNA时，如果用于mRNA提炼的细胞数多，就能获得合成cDNA文库所必需的足量mRNA。但是，由生体内只存在极少的细胞(例如千细胞或生殖细胞等)提炼mRNA等情况下，会对可用于合成cDNA文库的mRNA量产生很大的限制。在这种情况下，为了合成cDNA，需要扩增提炼的mRNA。于是，以往开发了对极微量的mRNA进行扩增的方法。 

作为上述那样的mRNA的扩增方法，一般有采用PCR来扩增mRNA的方法。mRNA的具体扩增方法如下。首先，由细胞提炼mRNA。其次，通过逆转印反应来调制cDNA。接着，以该cDNA为模板，通过DNA聚合酶来调制双链(double-stranded)DNA。然后，利用PCR来扩增该双链DNA。最后，使RNA聚合酶作用于扩增后的双链DNA，调制mRNA，获得扩增的mRNA(例如，参照专利文献1)。 

专利文献1：日本特开2002-238575号公报(2002年8月27日公开) 

但是，如上述专利文献1所记载的利用PCR来扩增mRNA的方法，存在不能以相同的效率扩增短的mRNA和长的mRNA的问题。 

具体说明则如 下。PCR具有可有效率地扩增较短的碱基序列但不能有效率地扩增较长的碱基序列的特性。因此，如专利文献1那样利用PCR来扩增作为mRNA模板的扩增用双链DNA的方法，可有效率地扩增具有较短碱基 序列的扩增用双链DNA，但无法有效率地扩增具有较长碱基序列的扩增用双链DNA。即，在合成mRNA时作为模板的扩增用双链DNA的扩增量因扩增用双链DNA碱基序列的长度而异。因此，在以利用上述PCR来扩增的用双链DNA为模板扩增mRNA的场合，可有效率地扩增较短的mRNA，但存在不能以相同的效率扩增较长的mRNA的问题。该缺点在想要制作多样性高的cDNA文库时会成为很大的问题。即，上述传统的方法存在这样的问题，即在作为cDNA文库最为重要的mRNA(cDNA)的量分布在得到扩增后，会广泛崩解的问题。 

故，强烈要求开发不受碱基序列长度的影响，不管短的mRNA还是长的mRNA都可同样有效率地扩增的微量mRNA的扩增方法。 

发明内容

本发明鉴于上述传统技术的问题构思而成，其目的在于提供不受碱基序列长度的影响而不论是短的mRNA还是长的mRNA都可同样有效率地扩增的微量mRNA的扩增方法及其应用方法。 

为了解决上述问题，本发明人认真进行研究的结果，发现当扩增对象的mRNA在反应液中仅存在极微量的场合，向反应液添加虚拟RNA(dummy RNA)并合成扩增用双链DNA，从而能够将扩增用双链DNA量增加至RNA聚合酶的最宜基质浓度(毫摩(mM)左右)，能够显著提升至今为止因基质浓度低而反应速度极慢的RNA合成反应速度，并可有效率地扩增mRNA。又，依据该技术，证实了由于不需要经过利用PCR来扩增双链DNA的工序，可不受其碱基序列长度影响而有效率地扩增mRNA，并完成了本发明。本发明基于该新颖的知识而完成，并包含以下的发明。 

即，为了解决上述问题，本发明的微量mRNA的扩增方法的特征在于包含：在包含微量mRNA的溶液中添加虚拟RNA来制作混合溶液的第一工序；使用混合溶液中的微量mRNA及虚拟RNA这两者作为模板，且通过利用对所述微量mRNA和所述虚拟RNA进行退火的引物的逆转印反应，合成所述微量mRNA和所述虚拟RNA的反义(anti-sense)DNA的第二工序；对于合成后的反义DNA合成互补的正义DNA，形成由正义DNA和反义DNA组成的双链DNA的第三工序；在所形成的双链正义DNA的正义DNA的5’末 端侧连接RNA聚合酶的启动子(promoter)序列制作扩增用双链DNA的第四工序；以及通过RNA聚合酶，由扩增用双链DNA扩增RNA的第五工序。