[发明专利]用于检测样品中活微生物细胞的分析方法

说明书

样品(如来自人的样品、食物样品或环境样品)的微生物污染可 以归因于许多不同类型的微生物。微生物可以作为单一菌落或者多种 类型的微生物菌落存在，并且(例如)细菌和真菌可以相等的或不同 的量存在于待测试样品中或待测试样品上。

目前检测微生物污染的方法涉及三磷酸腺苷(在此称为ATP)的 检测，因为它存在于所有的生活物质中。生活物质中ATP的存在意味 着这种化合物提供了存在生物(例如微生物)的良好指示。

最经常用于定量检测ATP的方法之一是让该化合物与荧火虫荧光 素酶反应。ATP的荧火虫荧光素酶反应采用纯化的酶(萤火虫荧光素 酶)、底物(D-荧光素)、镁离子和氧。用光度计测量通过ATP与D- 荧光素及氧的反应而产生的光。在合适的条件下，由该反应产生的光 的强度与样品中存在的ATP的量成比例。该反应中产生的光是作为连 续发光发出，这使得该分析更可靠，因为就分析员而言，它减少了对 精确选择时间以观察结果的依赖。

当测量包括活微生物(其也称作活细胞生物量或活微生物细胞) 的样品时，该样品中存在其他细胞和有机物质污染物。这种另外的有 机物质(其也含有ATP)也可通过包括萤火虫荧光素酶反应在内的已 知分析方法检测。如果也检测到这种“细胞外”ATP(其由于样品中的 污染物而存在)，则这可能会导致不正确地测量样品中的活细胞生物 量的水平。这是因为检测到了来自污染物的ATP以及来自活微生物的 ATP。事实上，检测到细胞外ATP水平，这会因为比预期读数高而给 出对活细胞生物量水平的错误指示。这在分析(例如)食物样品或将 用于保健的产品时是非常不期望的，因为在食物样品和保健产品中， 对可存在于要使用的物品上的微生物水平有严格的限制。如果超出了 这些限制，则必须丢弃该物品，这导致了高水平的损耗和花费。因为 已知的分析检测到细胞外物质，所以常常给出对活细胞生物量的错误 指示，并因而是已知的分析的一个严重缺陷。诸如保健品之类的产品 可能会在不必将它们扔掉时而被扔掉，因为事实上，如果给出正确的 测量，则真实的活细胞生物量是在期望的限度之内。因此，有效除去 不归因于活性生物量的ATP的方法是期望的。

已经开发了用以从样品除去ATP的方法。当评估样品(如食物样 品、冷却塔水样品或流出物样品)中存在的活性生物量的量时，通常 会在从微生物细胞提取ATP之前除去位于活微生物细胞外的ATP(细 胞外ATP或外来ATP)。该步骤使得能将那些微生物细胞中的ATP 与大量的细胞外ATP或外来ATP区分开来，这些细胞外ATP或外来 ATP与样品中的有机物质和源自待检测的食物样品或其他类型样品中 的有机物质的非微生物细胞(所谓的“体”细胞)相关。

已知ATP降解酶可用于在提取细胞ATP之前除去细胞外ATP。 其中所使用的合适的酶通常是胞外ATP酶，并且特别是腺苷三磷酸双 磷酸酶。腺苷三磷酸双磷酸酶是催化ATP水解生成二磷酸腺苷(ADP) 和无机磷酸盐的酶。在第二个步骤中，它们可以进一步使ADP降解成 一磷酸腺苷(AMP)和无机磷酸盐。对于最佳活性，它们需要诸如钙 或镁之类的二价阳离子。

腺苷三磷酸双磷酸酶可以从包括马铃薯、豌豆和细菌在内的一系 列来源获得。来自各种来源的腺苷三磷酸双磷酸酶显示出较大程度的 同源性，特别是对于酶的活性位点。

获自马铃薯的腺苷三磷酸双磷酸酶已经广泛用于在用荧火虫荧光 素酶反应分析微生物ATP之前除去细胞外ATP。检测和统计体液中的 细菌的方法已经在美国专利No.3,745,090中有所讨论。另外，马铃薯 腺苷三磷酸双磷酸酶已经在许多针对(例如)水、啤酒、软饮料、酒、 食品和多种其他产品中的活微生物细胞的分析中起到了重要作用。

然而，存在三个与除去ATP样品的方法相关，并且尤其是与用腺 苷三磷酸双磷酸酶除去与微生物细胞不相关的ATP相关的主要问题。

第一，通过腺苷三磷酸双磷酸酶除去ATP不是一个快速的过程。 通常它是整个生物量评估过程中最慢的步骤，对于高通量的取样这是 不期望的。提取和ATP测量步骤可以以秒为时间尺度进行，而用腺苷 三磷酸双磷酸酶除去细胞外ATP则需要以分钟作为时间尺度。5-30分 钟范围内的处理时段是典型的。