[发明专利]检测核酸的系统和方法

说明书

本申请要求2006年12月29日提交的美国第60/877,611号临时专利申请的权益，通过引用的方式将其整体并入本文。

本文所用的章节标题(section headings)仅是出于组织目的，不应当理解为以任何方式限制本文所述的主题。

发明领域

本申请一般涉及检测生物分子的方法和系统，特别是涉及检测样品中核酸的方法和系统。

发明背景

核酸的扩增可以与多种测定联合进行。此类测定可以是定性的，例如当用于评估生物样品时。然而，通过检测靶核酸的扩增，可改善多种生物学应用，而无需麻烦的印迹技术或光学方法通常所需的昂贵且易损坏的设备

因此，仍然需要改进检测样品中核酸的方法。

发明概述

根据第一实施方案，提供了检测样品中靶核酸的方法，其包括：

通过将样品加热至第一温度，解链样品，其中样品包含：

与靶核酸的至少一部分杂交的引物；

包含第一和第二区域的杂交探针，其中第一区域与靶核酸的至少一部分杂交，且第二区域不与靶核酸杂交，且其中第二区域包含可检测的标记；和

聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中聚合酶在杂交的探针的方向上延伸杂交的引物，且酶的核酸外切酶活性切割杂交的探针，由此释放包含探针的第二区域和可检测标记的探针片段；和

其中，第一温度高于引物和存在于样品中的双链核酸的T_m；

随后，通过将温度降至低于第一温度的第二温度，将样品退火，以便使引物和杂交探针与样品中靶核酸的单链部分各自杂交；和

随后，通过使聚合酶在第三温度下延伸与靶核酸杂交的引物，延长引物；

使酶的核酸外切酶活性切割杂交探针，由此释放探针片段；

任选地重复解链、退火和延长至少一次；

将样品与固相支持体的表面接触，其中固相支持体的表面包含一个或多个与探针片段第二区域的至少一部分杂交的捕获探针；

使捕获探针在第四温度下与存在于样品中的探针片段的至少一部分杂交，其中第四温度低于第二和第三温度；以及

检测固相支持体表面上的标记；

其中杂交探针的至少一部分与杂交探针的另一部分杂交，由此形成折叠结构，且其中，所述折叠结构的解链温度(T_m)低于第三温度但高于第四温度。

根据第二实施方案，提供了检测样品中靶核酸的试剂盒，其包含：

杂交探针，其包含与靶核酸的至少一部分杂交的第一区域和包含可检测标记的第二区域，其中第二区域不与靶核酸杂交，且其中，当与靶核酸杂交时，核酸外切酶能够切割杂交探针，由此产生包含第二区域和可检测标记的探针片段；

固相支持体，其包含位于其表面上的捕获探针，其中所述捕获探针与探针片段的第二区域杂交；

任选地，引物，其与靶核酸的至少一部分杂交；以及

任选地，聚合酶和具有核酸外切酶活性的酶，其中聚合酶在杂交的探针方向上延伸杂交的引物，且酶的核酸外切酶活性切割杂交的探针，由此释放包含探针的第二区域和可检测标记的探针片段；

其中，所述杂交探针的至少一部分与该杂交探针的另一部分杂交，由此形成折叠结构，且其中折叠结构的解链温度(T_m)低于完整的杂交探针与靶核酸杂交时所形成的双链体的解链温度，且高于探针片段与捕获探针杂交时所形成的双链体的解链温度。

附图简要说明

本领域技术人员能够理解下文所述的附图仅仅是出于示例的目的。所述附图并非是用来以任何方式限制本文教义的范围。

图1A是设计使用能形成折叠结构的杂交探针的测定的组成和步骤的示意图，其中可将杂交探针可与靶序列杂交，杂交的探针的一部分经切割形成标记的探针片段，且其中可在表面(如利用电极表面)上捕获和检测标记的探针片段。

图1B是显示预测的T_m为61.7℃的杂交探针的预测的折叠结构的图解。

图2是显示电化学信号的柱状图，所述信号是由具有图1B所示的核苷酸序列的杂交探针在不同的时间和温度下经40个聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)循环后产生的。

图3A是显示预测的T_m为43.9℃的杂交探针的预测的折叠结构的图解。

图3B是显示电化学信号的柱状图，所述信号是由具有图3A所示的核苷酸序列的杂交探针产生的。

图4是显示预测的T_m为34.2℃的杂交探针的预测的折叠结构的图解，其中该杂交探针与图3A所示的探针的差异在于从图3A所示的探针中移除了6个3’核苷酸。