[发明专利]快速转化单子叶植物的方法

说明书

发明背景

本申请要求2006年8月31日提交的第60/841,519号美国临时申 请的优先权，该临时申请的全部公开内容通过引用结合到本文中。

1.发明领域

本发明主要涉及植物生物技术。更具体的说，本发明涉及改进了 的用目的基因转化单子叶植物的方法。

2.相关技术的描述

植物生物技术中的基于基因组的方法已使得可以鉴定和分离大 量的基因，并使得对这样的可靠且有效的高通量转化生产系统的需要 成为必要，该系统用于通过将这些基因转化到经济上重要的单子叶植 物如玉米中来试验它们的有用性。农杆菌(Agrobacterium)介导的单子 叶植物如玉米、水稻和小麦的转化，是一种广泛使用的实验方法，这 种方法往往使用分生组织如不成熟胚作为所选的外植体(例如Ishida 等，1996；Zhao等，2001；Frame等，2002)。对于水稻，吸胀种子的转 化也有报道(Toki等，2006)。到目前为止，在使细胞与农杆菌接触之 后最普通方法包括：培养外植体组织如不成熟胚(“共培养”)，可能包 括“延迟”或“静息”(非选择性)步骤在内，接着在含有植物生长素的选 择培养基上进行培养，使细胞去分化以形成愈伤组织。在这个形成愈 伤组织的时期，被转化的抗性愈伤组织在选择培养基上的适当选择剂 的存在下得到选择。接着是使细胞在再生和生根培养基上，在能促进 愈伤组织发生分化和愈伤组织再生成植株的条件下进行生长。这个方 法通常需要至少10-12周才能产生出可转移到土壤进行进一步生长 的植株。这个方法还需要在转化过程中手工进行几次组织转移，要使 用到几种不同类型的培养基。

因此，使用标准的转化和再生方案是费时而低效的，会对转基因 产品开发时间线(timeline)造成消极影响，因为基于初始研究期间获得 的结果，作出关于哪些遗传构建物优先用于更大规模的转化工作的决 策的“优先开发窗口(priority development window)”，通常是受季节限 制的。因此，在单子叶植物转化领域存在这样的需求，即快速产生转 基因植株，以为在优先开发窗口期间作出研究和产品开发决策提供更 多的时间和灵活性。这种玉米转化的高通量系统会产生出大量的转基 因植株供试验基因和创造有用植株，同时降低材料和人工成本。

此外，不同培育品系的胚发生培养响应(embryonenic culture response)大不相同，这限制了可被转化的作物如玉米的基因型。因此， 一些品系能容易地形成胚性愈伤，而一般来说许多品系不能形成任何 胚性愈伤。这些品系通常被认为是“顽拗”品系。这可能会要求使用非 精锐品系(non-elite line)来进行转化，因而会要求进行许多代的培育来 产生农艺学上精锐的转基因品种。因此，还存在对这样的转化方法的 需求，该方法能使至今为止“顽拗”的玉米基因型得到转化，使得产品 开发用的可转化品系的选择范围更广，而且可以筛选这些基因型的潜 在可转化性(transformability)。

发明概述

在一个方面，本发明提供产生转基因单子叶植株的方法，所述方 法包括：a)用至少第一选定DNA转化外植体；b)将外植体在包含有 效比例的细胞分裂素和植物生长素的第一培养基中进行培养，以促进 能够形成根(root)和/或枝条(shoot)的可再生结构的发育；和c)将外植 体在能支持根和枝条组织的同时生长的至少第二和/或第三培养基中 进行培养，以产生出再生的转基因单子叶植株；其中再生的被转化单 子叶植株在转化外植体的约4-8周之内产生。在一个实施方案中，所 述方法还可包括将再生的转基因单子叶植株转移到植物生长培养基。 在具体的实施方案中，生长培养基是非无菌基质(matrix)，包括包含 在穴盘(plug)中的非无菌基质在内。