[发明专利]用于多肽的双标记以容许质谱分析中的多通道化的化合物和方法

说明书

技术领域

本发明提供了通过质谱方法筛选目标(targets)的方法和工具。更特 别地，本发明的方法和工具容许利用同位素和同量异序肽标记(isotopic and isobaric peptide labelling)过程的组合利用液相色谱质谱法平行筛选 多个样品。

背景技术

来自高度复杂的混合物的蛋白质的分析和鉴定需要巨大的分辨能 力。通常用于分辨这样的混合物的两种方法是2-维凝胶电泳(2D-GE) 和(2维的)液相色谱法((2D)-LC)。

高分辨率2D-GE由Klose(1975)Humangenetik 26，231-243和 O′Farrell(1975)，J.Biol.Chem.250，4007-40021引进。2D-GE在分辨 率上是非常卓越的(＞5000蛋白质)，但是受到缺乏自动化和重现性的困 扰。此外，蛋白质例如疏水膜蛋白、碱性蛋白、酸性蛋白、非常大的 或非常小的蛋白质是难以分辨的。

对于逃避使用凝胶电泳鉴定的许多有前景的疾病标志物，2D-LC 提供了很好的选择，容许复杂的蛋白质混合物的高分辨率分离[Hanash et al.(2003)Nature 422，226-232；Lipton et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 99，11049-11054]。2D-LC方法比2D-GE更适合于分离较小的蛋 白质，并且自动化性和处理量显著地更好。已经描述了通过液相色谱 法分离蛋白质/肽消化物的几种技术，包括毛细管电泳(CE)、反相 (RP)HPLC、和2-维液相色谱法。

一般地，2D-GE或2D-LC分离的肽和蛋白质通过质谱法或通过测 定氨基酸组成和/或氨基酸序列来鉴定。

在通过质谱技术测定不同样品(例如，疾病对比对照)之间统计学上 显著的蛋白质表达差异方面最相关的难题是来自不同样品的MS信号 的相对定量。因而，高度希望的是开发一些方法，其容许平行地加工 多个样品来尽可能降低不同样品之间的技术上的变化性。

近来，已经引入了两种方法来实现这一点。第一种技术被称为同 位素编码的亲和标签(Isotope-Coded Affinity Tag，ICAT)技术，容许基 于相关蛋白质混合物的差异化同位素标签化进行定量的蛋白质组学分 析[Gygi et al.(1999)Nat.Biotechnol.17，994-999]。描述的ICAT试剂利 用了三种功能元件：用于还原的半胱氨酸残基的选择性标记的硫醇反 应基团(thiol-reactive group)，生物素亲和标签以容许半胱氨酸标记的肽 的选择性分离，以及同位素标签，其以两种同位素形式合成，“轻”(非 同位素)或“重”(利用²H或¹³C)形式。由于仅中度数量的产生的肽在 它的原始序列中含有半胱氨酸，所以消化的亲和纯化的样品的复杂度 显著降低。两种独立标记的肽样品(“轻”对比“重”)在它们进行分离 技术如液相色谱之前被组合(附图1)，随后是MS鉴定。