[发明专利]芳基硼酸在蛋白质标记中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及使用质谱法同时分析蛋白质样品的方法，其允许从断裂 的蛋白质的混合物中选择性分离肽。本发明进一步涉及用于纯化肽和质 谱数据的数据分析的技术。

背景技术

对于通过蛋白质组学方法分析复杂蛋白质样品(组织样品或体液如 血清，或尿)而言，样品通常被断裂成肽，分离肽并通过质谱法分析。在 这样的“鸟枪(shotgun)”法中需要克服的最大问题是降低断裂的肽的混合 物的复杂性。为了提供适合于通过现行质谱仪器(这些机器的最佳分析范 围约为2000-4000m/z)分析的碎片，通过用蛋白酶消化蛋白质，与原始 样品相比，待分析分子的数目显著增加。断裂之后由于混合物中的不同 的肽来源于相同亲本蛋白质，所以对所有这些肽进行分析有时可能是多 余的。另一方面，在亲本蛋白质鉴定中，对相应于相同蛋白质的数种肽 进行分析可用作进一步的确认。

然而，在某些分析中，并不需要分析所有来源于蛋白质的肽。通常， 一种或几种肽就足以确认样品中某种蛋白质的存在。为减少断裂后肽的 数目，已使用氨基酸的不同官能团来选择性分离或标记特定的肽。已被 描述适合于该目的的官能团是半胱氨酸的巯基，天冬氨酸、谷氨酸和羧 基端的羧基，赖氨酸和肽自身的氨基端的胺基团。

在蛋白质组学中半胱氨酸常用作用于选择性分离或标记肽的官能 团。其在所有蛋白质中的约85％中出现，并在多肽中平均以约2-3％的 频率出现。因此，仅分析蛋白质样品的含半胱氨酸肽被认为就足够代表 整个蛋白质库。此外，半胱氨酸的巯基不在任何其他氨基酸中出现，因 此得以进行特异性标签化或标记。然而，一个缺点在于蛋白质中的半胱 氨酸残基通常形成二硫桥键，其有助于蛋白质的三级或四级结构并因此 常成对存在。因此，使用半胱氨酸标记肽通常标记来自同一蛋白质的至 少两个肽，导致产生冗余信息。此外，半胱氨酸残基常位于有助于蛋白 质结构的蛋白质结构域内。在具有不同功能的蛋白质之间，这样的结构 域通常是保存的(conserved)。因此，基于其含半胱氨酸肽而明确地鉴定 蛋白质可能是困难的。半胱氨酸的另一个缺点是虽然半胱氨酸在蛋白质 中的出现率相对高，但其分布有些不均。尽管存在许多富半胱氨酸蛋白 质，但并非所有蛋白质都含有半胱氨酸(如核糖体蛋白)。因此，通过半 胱氨酸导向的标签化或标记某些蛋白质会被忽略，与此同时其他蛋白质 则会过度表现。最后，在样品操作期间，半胱氨酸残基可能被氧化。这 样被氧化的氨基酸不再能被用于巯基特异性标签化或标记。

组氨酸的咪唑基团，另一种蛋白质中的独特的官能团，基于其针对 金属所固有的亲和力，被广泛用于亲和层析，但很少用作用于蛋白质修 饰的靶点。

通常包含6组氨酸残基尾部的组氨酸标签化的生物分子通过固定化 金属离子亲和层析(immobilised metal ion affinity chromatography，IMAC) 被纯化。以正确构型存在的具有人工添加或天然存在的包含多个组氨 酸、半胱氨酸或色氨酸的序列的蛋白质可结合于含有共价结合的螯合金 属离子的柱基质。最常见的是，Ni螯合物层析在亲和层析中用作基质来 纯化已被表达为在蛋白质的N-或C-端具有一个或多个His₆标签的融合 蛋白质的重组蛋白质。通常，镍离子通过次氮基三乙酸基团连到柱基质 并与标签化的蛋白质中的组氨酸残基发生相互作用以交换水。使用增加 的咪唑浓度梯度或以步进方式来进行洗脱。除Ni²⁺之外，其他金属离子 也适用于IMAC，例如Cu²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺。

在Mirzaei & Regnier(2005)J.Chrom.B 817，23-34中综述了使用 IMAC从胰蛋白酶消化物中选择含组氨酸肽。WO2006064451中描述了 使用芳基硼酸通过咪唑基团将诊断骨架(diagnostic shells)偶联至抗体， 其基于Collman等(2001)J.Org.Chem.66，1528-1531中描述的铜催化 的反应(参见图1)。硼酸(boronic acid)已知在医药领域中作为在高于pH 8.0下与糖的顺式二醇基团共价结合的试剂。硼酸修饰的肽的用途被描 述为用于抑制丝氨酸蛋白酶。

发明内容