[发明专利]一种诊断方法和用于此的试剂盒

说明书

技术领域

本发明主要涉及诊断领域并且提供用于精确评估来自受试者的样 品中特定细胞类型，其细胞结合蛋白或其可溶(细胞外)形式的存在 或数量的方法和试剂。在一些实施方案中，本发明涉及快速的，自足 的诊断，所述诊断可以在大部分环境中使用，例如诊所，实验室，在 野外，在家和在资源贫乏的地区。在一个实施方案中，提供用于评估 来自受试者的样品中的CD4T细胞数目的方法和试剂盒。

背景技术

主题说明书中的参考文献的著书目录的详细资料还列于说明书结 尾。

在本说明书中对任何现有技术的引用不被认为，也不应被认为是 这样的承认或任何形式的暗示，即该现有技术在任何国家中构成公知 常识的部分。

不同领域的技术用于研究，分析，开发并且临床上用于检测目的 细胞。手动或自动技术可用于对特别设计的小室中的细胞进行计数， 其允许评估样品中的细胞数目。可以用特殊的染色剂对细胞进行染色 以区别细胞类型。组织化学技术可以用于进一步区分样品中的细胞。 还可以诊断细胞通过增殖或产生细胞因子响应特定抗原，结合其他细 胞，吞噬(engulf)其他细胞或通过趋化作用进行移动的能力。细胞 表面标记对于区分细胞类型和评估样品中特定细胞的数目来说特别有 用。很多技术使用抗体以检测标记的存在。

原核和真核生物体的细胞在其所有不同的形式下包含细胞膜，其 将细胞内容物与细胞外环境分隔开。细胞膜是选择性屏障，其决定进 出细胞的物质并且其还与其他细胞和细胞的环境中的分子一起承担复 杂的信号传导活动。细胞膜包含磷脂双层并且大多数跨双层膜或与双 层膜相互作用的分子在插入双层膜中的蛋白的帮助下实现跨双层膜或 与双层膜相互作用，所述的蛋白具有细胞质和细胞外部分。

通常，细胞与其环境的最初的相互作用经由在质膜上表达的受体 或细胞表面结合分子而产生。不管是通过结合内源性配体(例如细胞 因子或激素)还是外源性配体(例如抗原)，这些受体的活化引发从 细胞膜经细胞质到细胞核的生化级联。已知大量受体或细胞表面结合 蛋白质分子介导细胞：细胞相互作用和细胞：分子相互作用。这些包 括，例如，MHC蛋白，细胞因子，激素或神经递质受体，束缚配体，G 蛋白偶联受体，受体蛋白酪氨酸激酶，受体蛋白酪氨酸磷酸酶，蛋白- 丝氨酸/苏氨酸激酶和受体鸟苷酸环化酶。

在免疫系统中介导细胞-细胞识别或抗原识别的大多数蛋白包含 Ig或Ig样结构域，暗示它们具有共同的进化历史。这些蛋白包括抗 体，T细胞受体，分化簇(CD)抗原例如CD4，CD8和CD28蛋白，B 和T细胞受体以及与淋巴细胞和其他白细胞上的Fc受体结合的恒定多 肽链。已表征在白细胞表面上的蛋白约一半属于这一超家族。因此， 免疫系统的细胞表达一系列细胞表面蛋白，所述细胞表面蛋白的同一 性可以用于评估样品中不同细胞的数目和状态。

例如，可以用抗B和T细胞抗原受体的恒定区的抗体鉴别B和T 淋巴细胞。可分别基于共受体蛋白CD4和CD8的表达的基础上鉴别T 辅助细胞和细胞毒性T细胞。

流式细胞术是用于细胞鉴别和细胞计数的有力的工具。流式细胞 术检测并计数经过激光束的流中的单独的细胞。通过检查大量细胞， 流式细胞术可以对具有不同分子(例如表征B细胞的表面免疫球蛋白， 称为CD3的T细胞受体相关分子，和区别主要T细胞亚群(subset) 的CD4和CD8共受体蛋白)的细胞的百分数提供定量数据。用经荧光 染料标记的特异性抗体对混合群内的单独的细胞加标签，或例如，通 过特异性抗体接着通过经标记的抗免疫球蛋白抗体对混合群内的单独 的细胞加标签。然后经标记的细胞的悬浮混合物被迫经过孔，产生每 隔一段距离被逐一隔开的包含细胞的细的液体流。当各个细胞经过激 光束，细胞散射激光，并且结合到细胞上的任何染料分子将被激发并 且发出荧光。灵敏型光电倍增管检测散射光(提供细胞的大小和粒度 的信息)和荧光发射(提供经标记的抗体的结合信息从而提供各个细 胞的细胞表面蛋白的表达的信息)。如果使用两个或更多抗体，各个 抗体与不同荧光染料偶联，则数据可以以二维散点图的形式或作为等 值线图展示，其中对比第二个染料标记的抗体的荧光对第一个染料标 记的抗体的荧光作图，从而用一个抗体标记的细胞群体可以基于其与 第二个抗体的反应性进一步细分。