[发明专利]源自假单胞菌6-19的PHA合酶的突变体和使用该突变体制备乳酸酯均聚物或共聚物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及源自假单胞菌6-19(Pseudomonas sp.6-19)的聚羟基链烷酸酯合酶突变体，其中，该突变体可以使用乳酰辅酶A(lactyl-CoA)作为底物来生产乳酸酯聚合物和/或乳酸酯共聚物。本发明还涉及一种制备乳酸酯聚合物和/或乳酸酯共聚物的方法，其中，该方法使用所述聚羟基链烷酸酯合酶突变体。

背景技术

聚乳酸酯(PLA)是一种源自乳酸酯的常见生物可降解聚合物，其作为一种普通或者医用聚合物具有多种应用。目前，PLA通过聚合由微生物发酵产生的乳酸酯而制备，但是通过乳酸酯的直接聚合只能产生低分子量PLA(1000-5000道尔顿)。为了合成高分子量(＞100,000道尔顿)的PLA，可以使用通过链偶联剂聚合由乳酸酯的直接聚合得到的低分子量PLA的方法。然而，其具有如下缺点：如由于加入溶剂或者链偶联剂而使高分子量PLA的制备方法复杂，且还不容易除去该溶剂或者链偶联剂。目前，在制备高分子量的商业上可用的PLA的方法中，正使用一种其中将乳酸酯转化成交酯以通过交酯环的环化脱水作用合成PLA的方法。

PLA均聚物可以由使用乳酸酯的化学合成方法容易地获得，但是难于制备具有多种单体单元的乳酸酯共聚物，并且其商业可用性非常低。

同时，聚羟基链烷酸酯(PHA)是一种在例如磷、氮、镁、氧的其它营养元素缺乏而碳源过量时在微生物中积累作为碳和能量储存化合物的聚酯。由于PHA与源于石油的合成聚合物具有相似的性质，并且同时呈现出优异的生物降解性质，所以其被认为是合成塑料的替代性材料。

为了在微生物中产生PHA，需要将微生物代谢物转化成PHA单体的酶和使用PHA单体合成PHA聚合物的PHA合酶。当使用微生物生产PLA和乳酸酯共聚物时，需要相同的体系，并且除了提供羟酰辅酶A(PHA合酶的原始底物)以外，还需要能够提供乳酰辅酶A的酶。

因此，本发明发明人开发了一种使用源自丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)的丙酰辅酶A转移酶来提供乳酰辅酶A的体系，并且成功地制备了PLA和乳酸酯共聚物(韩国专利申请公开第10-2006-0121555号)。但是，其对于在2-位羟基化的羟基链烷酸酯具有较小的PHA合酶活性。在体外检测的对乳酰辅酶A的PHA合酶活性已经有报道，但是对乳酰辅酶A的PHA合酶活性据报道如上述一样非常低(Zhang等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，56：131，2001；Valentin和Steinbuchel，Appl.Microbiol.Biotechnol.，40：699，1994；Yuan等人，Arch Biochem Biophys.，394：87，2001)。因此，如果PHA合酶不能够有效地利用乳酰辅酶A且使用PHA合酶来生产PLA和乳酸酯共聚物，则合成的效率必定低。也即是说，因为乳酸酯(在2-碳位羟基化的羟基链烷酸酯)不是PHA合酶的适合底物，所以能够有效使用乳酰辅酶A的PHA合酶对于有效地合成PLA和乳酸共聚物是非常重要的。

发明内容

技术问题

因此，本发明的一个目的是提供能够有效使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶。

本发明的另一个目的是提供一种制备PLA和乳酸酯共聚物的方法，其中，所述方法使用含有能够使用乳酰辅酶A作为底物的PHA合酶基因和丙酰辅酶A转移酶基因的细胞或者植物。

技术方案

为了实现所述目的，本发明提供一种聚羟基链烷酸酯合酶突变体，该突变体使用乳酰辅酶A作为底物生产乳酸酯聚合物或者乳酸酯共聚物并且具有SEQ.ID No：10的氨基酸序列，其中，在SEQ.ID No：10的氨基酸序列的第481位的谷氨酰胺发生突变。

优选地，本发明提供聚羟基链烷酸酯合酶突变体，其中，选自在第130位的谷氨酸、在第325位的丝氨酸和在第477位的丝氨酸中的至少一个氨基酸进一步发生突变。

更优选地，本发明提供一种聚羟基链烷酸酯合酶突变体，该突变体使用乳酰辅酶A作为底物生产乳酸酯聚合物或者乳酸酯共聚物并且具有SEQ.ID No：10的氨基酸序列，其中，所述氨基酸序列具有如下任何一种突变：

a)S325T和Q481M；

b)E130D和Q481K；

c)S325T和Q481K；

d)E130D和Q481M；

e)E130D和Q481R；

f)E130D、S325T和Q481M；

g)E130D、S325T和Q481K；

h)E130D、S477R和Q481K；