[发明专利]用于鉴定软骨细胞表型稳定性以及筛选软骨形成影响因子的标记基因

说明书

发明领域

本发明涉及用于确定软骨细胞表型稳定性的方法和工具以及用于鉴定 可用于治疗软骨缺损及软骨相关疾病的化合物的筛选系统。

发明背景

修复软骨缺损主要通过手术方法完成，例如骨髓刺激技术或植入软骨形 成细胞(软骨细胞，软骨祖细胞和前体细胞，或可形成软骨的干细胞)。因此， 鉴定能够对体内软骨形成有正面影响的因子是有益的。比较理想的是鉴定出 能够对缺损部位内或其邻近部位存在的局部细胞介导的软骨形成有正面影 响的手术过程或治疗方法或化合物。另外，对于以细胞为基础的治疗措施来 说，鉴定出能够对已在体外扩增或传代的分离细胞群在体内稳定形成软骨的 能力有正面影响的因子或处理方法也是有益的。

文献已经报道过多种不同的方法，其中参与软骨形成的基因的表达被用 作筛选化合物的参数。US2002061514描述了一种方法，其中报告基因可对 转录因子SOX9产生反应。SOX9是一种高迁移率组(HMG)域转录因子，表 达于软骨细胞、软骨祖细胞和其他组织，已被证实是软骨细胞分化和软骨形 成所必须的。其他方法是以参与软骨代谢和骨软骨缺损的各个基因[如， WO02081745所述的骨质疏松症相关基因]的表达水平而建立的。

筛选方法在文献中也有描述，这些方法的基础在于细胞在体外向软骨的 分化。但是，研究发现，这些模型的预测价值是有限的，这些分析方法需要 大量的细胞，并且十分费时。

WO200466723提供了一种体内模型，其中在斑马鱼体内评价了化合物对 骨和软骨形成的效应。用于评价细胞稳定形成软骨的能力的一种最可靠方法 是将细胞植入到裸鼠的肌肉内，然后通过组织学分析方法评价产生的植入 物。利用这种裸鼠模型可以避免采用WO0124833所述的技术，但是这种方 法本身也是十分费时的，并且不适于高通量的筛选。本专利申请描述了根据 软骨形成的裸鼠模型鉴定出的分子标志物在评价用于移植目的的扩增或传 代细胞的软骨形成潜能中的应用。同样，US2003235813描述了一组用于评 价软骨细胞表型稳定性的合适标志物。然而，尽管这些标志物的鉴定为能在 体内产生稳定透明软骨的细胞群的鉴定提供了基础，但是依然有进一步改进 的需要。

发明概述

本发明的基础在于提供一种特异性标志物模式的新概念，这种特异性标 志物模式可作为任何给定环境内软骨形成的指示因子，即，对细胞来说无论 是天然的或者是诱导的环境，都被认为是可鉴定软骨形成影响因子的靶模 式。

相应的，本发明提供了一组标志物，该组标志物可用于可靠地预测一群 细胞的软骨形成潜能。这些标志物的表达水平可用于预测细胞群，例如，在 体外或在体内，在被植入到体内时或者被刺激时是否能够生成软骨。这组标 志物还提供了一种可靠的工具，用于确定一个给定处理对一群植入前的细胞 的软骨细胞表型稳定性的效应。另外，本发明还提供了组合治疗方案，该方 案包括给予关节内的干细胞或骨软骨细胞以及给予能影响所给予细胞群的 软骨形成潜能的药物。

根据本发明，细胞群在体外的表型稳定性被用于筛选试验中以鉴定能影 响体外和/或体内软骨细胞表型稳定性的因子。本发明提供了一组能指示软 骨细胞表型稳定性的标志物，这些标志物的表达被用于预测化合物和/或条 件对细胞群在体内生成软骨的能力的体外或体内效应。在筛选试验中使用这 些标志物可以使我们无需太长的时间和繁重的动物实验就能够筛选大量的 作用于软骨细胞的化合物和/或条件

在一个方面，本发明提供了确定一个细胞群稳定生成透明软骨的能力的 方法。更具体地说，本发明提供了在体外确定一个细胞群在体内稳定生成透 明软骨的能力的方法。在具体实施方式中，该方法包括确定细胞群表达一组 至少三个标志物基因的水平，这一组标志物基因包括FRZB、ALK1以及选 自PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一个或 多个标志物基因。

在本发明提供的方法的具体实施方式中，细胞群与化合物或条件接触。