[发明专利]基于人类胚泡来源的干细胞和祖细胞的新型毒性分析方法

说明书

发明背景

人类胚泡来源的干(hBS)细胞具有分化成所有三种胚层的衍生物 的独特能力。这种特点使得它们在毒理学领域中成为特殊的工具，因 为它们可以作为功能性细胞的“细胞工厂”(Moon SY等，Mol Ther 13(1)：5-14，2006)。此外，在hBS细胞分化过程中相互作用的化合物 的效应可以被检测，使得它们在发育毒理学领域中特别具有价值。

由于新的欧洲化学品政策(European Chemicals Policy)(REACH) 将在2007年生效，对于每年生产量或进口量超过1吨的3万种以上的 化学物质来说，需要它们的毒理学信息(Anon，2007)。因此，将可能 额外使用大约390万只试验动物，对工业界来说，花费估计为大约15 亿欧元，其中仅用于发育毒性研究的就占32％(RPA，2002)。因此， 对于体外发育毒性测试有紧迫的需求。此外，制药工业面临着高通量 体外毒性测试的需求，因为在开发阶段，新型药物候选物的可靠毒理 学数据必须尽可能早地产生。由于引入早期体外毒性筛选而使高的损 耗率降低，将在经济方面减少相关的花费。此外，已知有大量物质表 现出显著的种间差异，在人类中导致严重的畸变，但是在大鼠或小鼠 中不明显，例如用于治疗严重痤疮的13-顺式视黄酸(异维甲酸) (Accutane，Roche)以及镇静剂和抗炎性药物沙利度胺(Contergan) (Gilbert，2003)。因此，需要人类相关的发育毒性测试。

到目前为止，最有希望的体外胚胎毒性测试之一是被批准的胚胎 干细胞测试(EST)，它使用了鼠类胚胎干(mES)细胞来评估化学物 质的胚胎毒性潜力。EST考虑到了mES细胞和鼠类成纤维细胞对胚胎 毒性物质的不同敏感性。此外，mES细胞分化成功能性心肌细胞用作 毒理学终点(Genschow，2004)。但是，EST的目的仍然在于在动物系 统中预测人类毒性。

在发育毒性测试中使用人类胚胎干细胞可以提供可靠的，与人类 相关的数据，增加了现有的毒性测试的价值，可用于药物和化学物质 的安全性评估。但是，在毒性测试中使用hBS细胞是一种挑战，因为 这些细胞需要复杂的操作技术。例如，hBS细胞需要以细胞聚集物而 不是单一种细胞的形式接种以确保生长，并显示出可变的与表面结合 的能力，从而导致了高的差异。此外，hBS细胞的群体倍增时间是36 小时，明显长于mES细胞的12小时。小鼠和人类BS细胞的另一个重 要的差别是它们的培养条件。为了将mES细胞维持在未分化状态，在 培养基中加入白血病抑制因子(LIF)就足够了。但是对于hBSC细胞 株来说，将它们培养在小鼠或人类饲养层上，显示出是将细胞稳定地 维持在未分化状态的最可靠的方法。正在进行大量的工作以发现不需 饲养细胞的培养系统，但这些研究都处于开发的早期阶段(Stacey等， 2006)。

本发明阐述了基于hBS细胞的毒性分析方法，用于预测人类毒性， 例如发育毒性和细胞毒性。本发明显示出了明显超过mES的优点，能 够提供与人类相关的数据，有助于鉴定人类致畸原，这些致畸原中的 一些已知显示出种间差异，例如13-顺式视黄酸。这样的毒性测试具有 成为检测与人类相关的发育毒性物质的测试策略的一部分的潜力。

发明描述

定义与缩写

“分析方法”或“多个分析方法”用于描述所进行的在基因，蛋 白或功能水平上测量细胞毒性和/或发育毒性的体外测试。

本文中使用的术语“胚泡来源的干细胞”是指BS细胞，其人类形 式被称为“hBS细胞”或“hBSC”。

本文中使用的术语“祖细胞”或“祖细胞类型的细胞”是指任何 源自于hBS细胞的，处于未分化的hBS细胞和完全分化的细胞之间任 何分化阶段的细胞。

术语“饲养细胞”或“饲养物”是指一种类型的细胞，它与另一 种类型的细胞共培养，以提供使第二种类型的细胞能够生长的环境。 饲养细胞任选地可以来自与它们支持的细胞不同的物种。典型情况下， 饲养细胞在与其它细胞共培养时，可以通过辐照或用抗有丝分裂剂例 如丝裂霉素c处理进行失活，以防止它们长得比它们所支持的细胞快。 不受上面描述的限制，这样的饲养细胞的一种具体类型可以是人类饲 养细胞，例如人类皮肤成纤维细胞，在本文中称为hFF。在本发明的上 下中，hFF也是成体(adult)细胞类型的例子。另一种饲养细胞类型可 以是小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)。