[发明专利]由棒状杆菌属表达的阿拉伯糖异构酶和使用其制造塔格糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种在棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)菌株中表达的 阿拉伯糖异构酶基因和使用该基因制备塔格糖的方法，更具体地说，本 发明提供了来自新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)DSM 5068 的编码阿拉伯糖异构酶的基因、含有该基因的重组表达载体，通过在由 重组表达载体转染的食品级GRAS棒状杆菌属菌株中表达基因制备嗜 热性阿拉伯糖异构酶的方法，以及使用该酶由半乳糖制备塔格糖的方法。

背景技术

随着对舒适或者健康生活的兴趣日益增加，塔格糖已经被建议作为 糖的替代物，因为其具有更小的副作用，并且糖是引起各种成人疾病的 主要因素之一。塔格糖是半乳糖的异构体并且已知具有与果糖类似的生 理化学性质。塔格糖是天然的低热量糖，并且近来已经由美国FDA批准 为GRAS(通常认为是安全的，Generally Recognized As Safe)，于是目前 其被允许作为加甜剂被加入到食品、饮料、保健品、饮食添加剂等中。

GRAS表示通常被认可为安全的物质，所述安全由具有足够经验和 技能的专业人员通过科学程序并在指示条件和使用目的下检查来进行判 断。GRAS是仅在美国使用来评估食品和食品化学物质的安全性(在一 定条件下)的独特系统，但其在世界范围内被认可。

塔格糖还能通过半乳糖的异构化来生产，该异构化为使用催化剂制 造异构体的化学方法，或者使用异构酶对半乳糖进行酶转化的生物学方 法来生产。

本领域技术人员公知的一种生物学方法是使用酶将醛糖或醛糖衍 生物转化成酮糖或酮糖衍生物。使用阿拉伯糖异构酶将半乳糖异构化成 塔格糖一般在高温下通过热动力学来进行，并表现出成比例的高转化率。 因此，开发在高温下作用稳定的酶和使用其制备塔格糖的方法对于其基 于使用异构酶进行塔格糖的生物转化的工业应用来说是关键技术。通过 筛选源自阿拉伯糖异构酶的嗜热性菌，来尝试获得工业上可应用的嗜热 性异构酶，并且已经由许多研究团队付出了许多努力使用这种方法来建 立异构化工艺。

在韩国，使用阿拉伯糖异构酶的酶异构化方法已经由Tong Yang Confectionery Corp开发。根据该方法，来自大肠杆菌的阿拉伯糖异构酶 在大肠杆菌中通过重组技术同种表达。该重组异构酶在30℃下反应24 小时，将半乳糖转化成塔格糖，此时转化率为25％，表明热稳定性和转 化产量两者都非常低(申请号为99-16118的韩国专利申请)。Oh， Deok-keun教授和他的同事们(Sejong大学)成功地在大肠杆菌中进行 了来自嗜热脂肪土芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的阿拉伯 糖异构酶的表达，并基于此他们提出了在高温下将半乳糖转化成塔格糖 的异构化过程。本发明的发明人成功地从新阿波罗栖热袍菌克隆了新的 阿拉伯糖异构酶基因，并在大肠杆菌中生产阿拉伯糖，进一步发展了在 超嗜热性条件下使用酶制备塔格糖的方法(韩国专利10-0443865)。

使用来自嗜热性菌得到的阿拉伯糖异构酶的塔格糖的生产仍然依 赖于使用在重组大肠杆菌中大量表达的重组酶的方法，或者依赖于使用 含有重组酶的宿主将半乳糖异构化成塔格糖的方法。但是，这种使用重 组大肠杆菌的塔格糖的生物学生产不适于作为食物成分的塔格糖生产。 为了生产作为食物成分的塔格糖，在适于作为食物成分的塔格糖的大量 生产的GRAS微生物的宿主中表达的阿拉伯糖异构酶是必须的。

棒状杆菌是工业微生物，其已经被用于化学物质的生产，所述化学 物质可应用于各种领域，包括含L-赖氨酸、L-苏氨酸和各种核酸的饲料、 医疗用品和食品。棒状杆菌是GRAS(Generally Recognized As Safe)菌株， 其有利于基因操作和大量生产。另外，该菌株在各种工艺条件下均高度 稳定，并且与其他细菌相比具有较稳定的细胞膜。因此，该菌株甚至在 由高浓度的半乳糖产生的高渗透压下也保持稳定。

本发明的发明人发现，来自超嗜热新阿波罗栖热袍菌的嗜热性阿拉 伯糖异构酶在GRAS棒状杆菌属菌株中以活性形式过表达，并进一步通 过发展新的技术完成本发明，通过使用来自棒状杆菌属的表达的重组酶 诱导来自高浓度的半乳糖的塔格糖异构化。

发明内容

技术问题