[发明专利]由GRAS表达的食品级嗜热性阿拉伯糖异构酶以及使用其制备塔格糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种嗜热性阿拉伯糖异构酶和使用其制备塔格糖的方 法，更准确地，涉及来自嗜热脂肪土芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)DSM22的编码阿拉伯糖异构酶的基因，含有该基 因的重组表达载体，由从所述表达载体转化的重组GRAS(通常认为是安 全的，Generally Recognized As Safe)菌株制备食品级嗜热性阿拉伯糖异 构酶的方法，以及通过使用所述酶由半乳糖制备塔格糖的方法。

背景技术

随着对舒适或者健康生活的兴趣日益增加，塔格糖已经被建议作为 糖的替代物，因为其具有更小的副作用，并且糖是引起各种成人疾病的 主要因素之一。塔格糖是半乳糖的异构体并且已知具有与果糖类似的生 理化学性质。塔格糖是天然的低热量糖，并且近来已经由美国FDA认证 为GRAS(Generally Recognized As Safe)，于是目前其被允许作为加甜剂 被加入到食品、饮料、保健品、饮食添加剂等中。

GRAS表示通常被认可为安全的物质，所述安全由具有足够经验和 技能的专业人员通过科学程序并在指示条件和使用目的下检查来进行判 断。GRAS是仅在美国使用来评估食品和食品化学物质的安全性(在一 定条件下)的独特系统，但其在世界范围内被认可。

塔格糖还能通过半乳糖的异构化来生产，该异构化为使用催化剂制 造异构体的化学方法，或者使用异构酶对半乳糖进行酶转化的生物学方 法来生产。

本领域技术人员公知的一种生物学方法是使用酶将醛糖或醛糖衍 生物转化成酮糖或酮糖衍生物。使用阿拉伯糖异构酶将半乳糖异构化成 塔格糖一般在高温下通过热动力学来进行，并表现出成比例的高转化率。 因此，开发可在高温下具有稳定作用的酶和使用其制备塔格糖的方法对 于基于使用异构酶进行塔格糖的生物转化的工业应用来说是关键技术。 通过筛选源自嗜热性菌的阿拉伯糖异构酶，来尝试获得工业上可应用的 嗜热性异构酶，并且已经由许多研究团队付出了许多努力使用这种方法 来建立异构化工艺。

在韩国，使用阿拉伯糖异构酶的酶异构化方法已经由Tong Yang Confectionery Corp开发。根据该方法，来自大肠杆菌的阿拉伯糖异构酶 在大肠杆菌中通过重组技术大量表达。将该重组异构酶在30℃下反应24 小时，使半乳糖转化成塔格糖，此时转化率为25％，表明热稳定性和转 化产量两者都非常低(申请号为99-16118的韩国专利申请)。Oh， Deok-keun教授和他的同事们(Sejong大学)通过重组技术成功地在大 肠杆菌中实现了来自嗜热脂肪土芽胞杆菌的阿拉伯糖异构酶的表达，并 基于此他们提出了在高温下将半乳糖转化成塔格糖的异构化过程。Tong Yang Confectionery Corp的研究组通过筛选嗜热性微生物文库从温泉区 域分离嗜热性微生物，然后在重组大肠杆菌宿主中以活性形式对其进行 表达，以便将半乳糖用于高温异构化过程。类似地，CheBiGen Inc.也在 大肠杆菌中生产了来自Geobacillus dinitrificans DBG-A1的嗜热性异构 酶，并使用该酶通过固定化开发了生产塔格糖的技术。

来源于土芽胞杆菌(Geobacillus)微生物的异构酶的表达水平太低而 不能在工业中应用。使用源自嗜热性菌阿拉伯糖异构酶的塔格糖生产仍 依赖于使用在重组大肠杆菌中重组酶的大量表达或者使用含有重组酶的 宿主将半乳糖异构化成塔格糖的方法。大肠杆菌对于作为食品原料的塔 格糖的生产来说是不合适的。为了生产作为食品添加剂的塔格糖，在该 宿主中表达阿拉伯糖异构酶是必须的，该宿主为GRAS微生物并适于大 量生产。

对于重组酶生产来说可工业应用的GRAS微生物可选自由芽孢杆菌 属(Bacillus sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)和乳杆菌属 (Lactobacillus sp.)组成的组。很容易操纵芽孢杆菌属和棒状杆菌属菌 株用于工业化和大量培养，并且它们在各种条件下高度稳定。事实上， 在GRAS微生物中，绝大多数芽孢杆菌属和棒状杆菌属菌株已经被用作 用于重组酶生产的宿主。

本发明的发明人成功地在GRAS微生物诸如芽孢杆菌属和棒状杆菌 属菌株中以活性形式表达了来源于土芽胞杆菌的嗜热性阿拉伯糖异构 酶。本发明的发明人通过使用所述表达的GRAS重组酶进一步建立了将 高浓度半乳糖诱导异构化成塔格糖的方法。

发明内容