[发明专利]用于控制细胞培养物生长的方法

说明书

发明领域

本发明涉及高细胞密度培养领域。更具体地，本发明涉及一种用于通过补料分批技术(fed-batch)来控制培养基中培养的微生物生长至高细胞密度的方法。

发明背景

振荡培养物通常是在培养之初便添加所有成分的分批培养物。非受控的振荡培养物中容易出现过高的基质(substrate)浓度、不充分的通气、不受控制的生长、有害代谢物的合成(溢流或无氧代谢)、分解代谢物阻遏、甚至基质中毒。振荡的大肠杆菌培养物中的生物质(biomass)产率范围通常为1-2g/l(干重)，微小规模(microscale)时通常更低。通过精心设计的基质补料和pH控制，在常用的常规实验室或工业生物反应器中可生产高达50倍以上的生物质。较大规模中应用的控制策略(连续监测和控制)不易应用于少量的振荡培养物。连续监测和补料的设置在小规模中难以实现。非受控的生长和不充分的通气会很快引起氧耗尽。氧限制期间，发酵产物(乙酸根(acetate)、CO₂、甲酸、乳酸、乙醇、琥珀酸)大量形成会抑制细菌生长和损害重组蛋白质过程的量形成。若葡萄糖摄取和糖酵解快于柠檬酸循环的能力，则这些代谢物中的一些还可在需氧条件下合成。在此类溢流代谢期间，乙酰CoA转变成被分泌至培养基的乙酸根。还可在长期暴露于高浓度葡萄糖期间(即使在需氧条件中)发生呼吸作用的分解代谢阻遏(Crabtree效应)。

为了避免氧限制、溢流(over-flow)代谢和Crabtree效应，生物反应器中的高细胞密度培养物通常应用补料分批技术。在基质受限的补料分批培养中，可用一种限制性基质(通常为作为唯一碳源使用的葡萄糖)控制细菌生长率。氧消耗随着呼吸活性(基质使用)和生长率增加。因此，可通过抑制微生物生长，也可通过基质限制来避免氧限制。然而，大多数简单培养是在摇瓶中在没有检测或补料可能性的情况下进行的。所应用的培养方法通常是分批培养。生物质产率通常保持低下，而且如此生产的培养物的品质是不可预测的，并且通常是差的。用分批方法达不到高细胞密度，因为此细胞密度要求如此之高的最初营养物浓度以致其会对微生物有毒。

因为测量和补料装置通常不可应用于简单的振荡培养物，因此已经开发了备选的策略。在医学疗法中，通常通过在一段长时间里缓慢释放基质来提供药物。药物投递样系统很少应用于微生物培养中，因为基质通常是小分子(诸如葡萄糖和氨水)，对此释放率难以控制。通过“药物投递”样系统，Lübbe等(ApplMicrobiolBiotechnol(1985)22：424-427)已经在带小棒链霉菌(Streptomycesclavuligerus)培养中提供NH₄Cl，而且最近，Jeude等(BiotechnolBioeng(2006)Vol.96，No.3：433-443)已经使用含有葡萄糖的硅氧烷弹性体(聚二甲基硅氧烷)盘来产生补料分批样培养条件(还可参见Büchs等WO2006/119867“Fermentationmethodandapparatusforitsimplementation”)。可将这些盘添加至培养容器，但是它们不是培养容器的整合部分。然而，仅可将相对少量的葡萄糖包入此衬质(matrix)中。此外，通常在培养开始时此衬质的葡萄糖释放率最快，此时微生物质最低而溢流代谢的风险最高。这可解释为何此类系统未曾在生物技术方面最重要的细菌种类，即大肠杆菌(Escherichiacoli)的简单培养中快速流行。

Tyrell等(J.Bacteriol75(1958)：1-4；“Biphasicsystemforgrowingbacteriainconcentratedculture”)已经提出了一种用于将营养物样酵母提取物包入凝胶中的方法。然而，该方法没有控制营养物释放率的可能性，特别地，该凝胶的葡萄糖释放非常快地发生。因此，不可应用于高细胞密度培养。该方法从未变得流行，因为富含营养物的、良好缓冲的复合培养基样超级肉汤(superbroth)或极端肉汤(terrificbroth)更易于使用，并提供更高的细胞密度。